筍用竹正常植株和病害植株根際微生物的分析

駱棟卿

(廣西壯族自治區(qū)國有高峰林場(chǎng)，廣西南寧530001)

筍用竹不僅是綠色資源，還可以應(yīng)用到保健藥物中，成為保健食品。在現(xiàn)代生活中，加工筍用竹已成為新時(shí)期中的新型行業(yè)。目前，我國筍用竹生長(zhǎng)對(duì)地域與季節(jié)有較高的要求，如果在淡季種植筍用竹，那么好的竹筍與筍用竹便會(huì)有所減少，因此，在竹筍種植的過程中，應(yīng)加強(qiáng)生理上的特性，加強(qiáng)對(duì)淡季竹子和生態(tài)環(huán)境的分析。以此為今后的研究提供有效的理論依據(jù)。

本次研究的目的是分離和鑒定具有病害和正常竹筍根際微生物，比較兩者檢驗(yàn)出的結(jié)果，為竹筍的種植和病害防治提供參考資料。

1 筍用竹正常植株和病害植株根際微生物的實(shí)驗(yàn)研究

采樣點(diǎn)選擇的地點(diǎn)是廣西大學(xué)林學(xué)院，為亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)的氣候地區(qū)，此地域年平均氣溫為21.9℃，最高溫度是29℃，最低氣溫是-12.7℃，平均年降水量是1411.4mm，無霜期平均濕度在80%以上，年日照時(shí)間為1717.35h。竹園植被覆蓋率為85%，此竹園里種植多種竹子，如青竹、四季竹、慈祥竹、綠竹、佛肚竹等。

2 一般材料與方法

2.1 一般材料

試驗(yàn)材料均為二年生的筍用竹。正常植株高為3.5m左右，直徑為3.1cm左右，葉子的顏色屬于深綠色。病株高為2.8m，直徑在2.5cm。大部分葉子都會(huì)出現(xiàn)枯萎等癥狀，并且仔細(xì)觀察可以從葉柄處看見白色的害蟲。

2.2 方法

2.2.1 采樣方法

從東、南、北、西4個(gè)方向挖掘出竹根表層土壤，在10 An深度處可以發(fā)現(xiàn)竹根。從竹根的末端和中部段切斷。直徑為9mm，厚度為4mm的土壤。

“?”代表普通植物， “＠”代表病株， “?”代表竹園的空地，奇數(shù)表示根的末端，偶數(shù)表示根的中間”，并對(duì)收集到的土壤進(jìn)行編排。表1展示所有的情況。在實(shí)驗(yàn)的過程中，應(yīng)戴上無菌乳膠手套，將土壤揉成小于2mm的土樣，放入牛皮紙樣袋中，最后存放于4℃冰箱中，以便日后使用。

表1 植株采樣對(duì)比表

2.2.2 樣品處理

?1、?3、?5、?7的平均混合為1(以下4組樣品以相同的方式混合)，?2、?4、?6、?8。＠1、＠3、＠5、＠7為3號(hào)；＠2、＠4、＠6、＠8為4號(hào)；?1、?2為混合性5號(hào)。

2.2.3 微生物種群的分離

從編號(hào)為1/2345的5份樣品中取出14g樣品，分別放入裝有150mL無菌水的三角瓶中，固定棉花塞，振動(dòng)30min無菌操作，1mL稀釋成為5個(gè)數(shù)量級(jí)，稀釋10、10、10、10、10?，并將Q1mL分別用在3種細(xì)菌和真菌培養(yǎng)上。細(xì)菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基分別在34℃、27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)滿24h后進(jìn)行觀看。

2.2.4 微生物種群的純化

培養(yǎng)24h后，選擇不同菌落并接種到培養(yǎng)基中。在恒溫條件下振蕩培養(yǎng)6h后，細(xì)菌按照規(guī)定的程序再次進(jìn)行分離培養(yǎng)，直到平板上的所有菌落與肉眼沒有明顯差異。然后單一菌落在培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，將液體在斜面上孵育24h，然后保存在冰箱中，防備日后使用。

2.2.5 微生物的分類鑒定

生理生化鑒定方法：描述第1批分離菌落 (平涂24h)的形態(tài)，包括菌落大小、形狀邊緣、突起、干燥、透明質(zhì)、顏色以及菌落數(shù)量，并在諸多菌落中識(shí)別出相同或相似的菌落。

革蘭氏染色：培養(yǎng)6h，將細(xì)菌環(huán)固定在玻璃玻片上，用1 min的洗滌碘染成結(jié)晶紫，放置在空氣干燥的地帶，用脫色液洗凈30次，在此渲染洗干2min。以致顯微能夠觀察到顏色的形態(tài)。

孢子染色：培養(yǎng)24h后取菌液，并固定在玻璃玻片上，飽和孔雀石綠色染色10m再洗干，直到菌絲體呈紅色孢子呈綠色為止。

暴露酶實(shí)驗(yàn)：分離培養(yǎng)24h的細(xì)菌液體，用3%過氧化氫涂抹在玻片玻璃上，觀察是否產(chǎn)生氣泡。

半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)：將細(xì)菌液體接種于半固體試管培養(yǎng)基中，接種環(huán)6h，培養(yǎng)24h，最后觀察細(xì)菌是否產(chǎn)生了擴(kuò)散的跡象。

明膠反應(yīng)：在明膠培養(yǎng)基上接種30h后，培養(yǎng)6d以后，觀察明膠液化是否發(fā)生了變化。

耐鹽板：在不同濃度的鹽板上培養(yǎng)24h后，觀察細(xì)菌在室溫下的生長(zhǎng)情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同植株的根際微生物數(shù)量

根際土壤樣品在選擇性細(xì)菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基后。培養(yǎng)出的基稀釋涂布盤 (細(xì)菌10倍，10倍的真菌)，以及不同植物根際微生物在培養(yǎng)皿中形成的菌落如圖1所示。

圖1 不同植株的根際微生物數(shù)量圖

同時(shí)，在此對(duì)不同形態(tài)的菌落進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明根部微生物數(shù)量多于根部數(shù)量，因此得出筍用竹微生物最多的部位是根部；病害植物根際微生物數(shù)量比正常植物中的微生物較多；根際微生物數(shù)量少于對(duì)照土壤；平均土壤中根際細(xì)菌的ER為1×10 CFU；竹筍根際真菌平均數(shù)量為9.4×10 CFU，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

3.2 不同植株的根際微生物種群

3.2.1 細(xì)菌初步鑒定及種群的比較

通過菌落形態(tài)鑒定、形態(tài)分類、革蘭氏菌、明膠液化、接觸菌的鑒定中，可以初步鑒定正常筍用竹與病株竹筍根際微生物的類型。198株細(xì)菌中從正常植物根際土壤中可以分離出6屬，229株細(xì)菌可以從病株根際土壤中分離出8屬。其中，芽孢桿菌、變形桿菌、農(nóng)桿菌屬優(yōu)勢(shì)種群，Bocholderia病株是根際微生物所存有的一種菌屬。與正常植物根際細(xì)菌相比，病株根際細(xì)菌數(shù)量較多，病菌的群體也比較廣泛，有可能與正常植物的抵抗作用能力有著密切的聯(lián)系。

表2 筍用竹正常植株與病害植株的根際微生物的數(shù)量

表3 筍用竹正常植株與病害植株的根際細(xì)菌種類及數(shù)量(菌株數(shù)·株-1)

3.2.2 真菌初步鑒定及種群比較

以孟加拉紅和鏈霉素為篩選劑。根據(jù)菌落、細(xì)胞形態(tài)和孢子的特征，初步對(duì)菌類進(jìn)行鑒定，結(jié)果表4所示。48種真菌可以從正常植物根際土壤中分離出4個(gè)屬。而從60種真菌可以從病株根際土壤樣品中分離出6屬，表格中明顯表示了這幾個(gè)種屬。表4中的毛霉、青霉、曲霉和酵母菌屬于相同屬，每個(gè)屬種基本都相同；正常植物根部真菌的數(shù)量比根部中間的真菌較多，病株根部和根部中部的真菌數(shù)量是相同的，其中的因素有可能是因?yàn)橹参锏慕】蹬c外界的干擾因素有較大的關(guān)系；Puccinia phyllostachys和普通鐮刀菌是病害植物根際土壤中特有的一種。

表4 筍用竹正常植株與病害植株的根際細(xì)菌種類及數(shù)量(菌株數(shù)·株-1)

3.2.3 致病微生物的分析

普通變形桿菌、Bockhord nion Puccinia mongolica和Fusarium vulgaris都被稱為致病菌，但普通變形桿菌Bockholderia cepacia一般病菌都會(huì)出現(xiàn)在小動(dòng)物身上，沒有相關(guān)植物感染的報(bào)告。因此，普通變形桿菌、頭孢菌素并不是是竹筍致病菌。感染病害的筍用竹莖有黑點(diǎn)、葉柄粉狀、葉片呈黃色、根系統(tǒng)也有黑斑、EM明顯變短、整體會(huì)慢慢腐爛，最后部分死亡。因此，根據(jù)以上狀況可以判定該植物應(yīng)感染了Puccinia phyllostachys和普通鐮刀菌。

4 小結(jié)與討論

從正常植物根際土壤中分離到198株細(xì)菌和48株真菌，從根際土壤中分離到229株細(xì)菌與60株真菌。其中，芽孢桿菌與農(nóng)桿菌屬是常見群體，變形桿菌和Bockholdsp是病株根際微生物特有的兩種菌類。而屬毛霉、青霉、曲霉和酵母菌中的每個(gè)屬的數(shù)目基本相同。銹菌屬和鐮刀菌屬是病害植株植物根際土壤特有的物種。

與筍用竹正常植株根際微生物相比，病株根際微生物數(shù)量較多，種族比較廣，產(chǎn)生此原因有可能與正常植株根際微生物抵抗作用有關(guān)。根部末端的微生物數(shù)量比根部、中部的微生物數(shù)量較多。筍用竹正常植株細(xì)菌在土壤中根際細(xì)菌的平均數(shù)為1.1×10 cfu，而真菌平均數(shù)為9 4×10 cfu。

通過對(duì)平板菌落數(shù)和菌落特征的描述，發(fā)現(xiàn)在病竹中培養(yǎng)根際微生物數(shù)量比正常筍用竹植株菌數(shù)較多，可以看出根際土壤中的微生物可以在植物根周圍形成保障區(qū)。在此種微生態(tài)環(huán)境下，保護(hù)植物根系可以有效降低病菌與害蟲侵犯的次數(shù)，因此，植物根際微生物的研究是研究防治植物微生物細(xì)菌的基礎(chǔ)。此外，在細(xì)菌研究的結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)了RHI中的主要細(xì)菌。相關(guān)研究結(jié)果表明，芽孢桿菌對(duì)水稻紋枯病和番茄青枯病有一定的影響，而芽孢桿菌對(duì)植物病原具有較強(qiáng)的拮抗能力與廣譜。這些微生物作為本地微生物，與植物雙方有一定的影響作用機(jī)制，了解和理解這些菌株之間所存在的關(guān)系以成為現(xiàn)代科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)話題之一。

在此鑒定中，檢測(cè)細(xì)菌的種類通常應(yīng)用形態(tài)學(xué)觀察法進(jìn)行鑒別，包括革蘭氏的運(yùn)動(dòng)觀察等方法。對(duì)生理和生物進(jìn)行了厭氧、好氧、完全培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)、生物降解性試驗(yàn)等化學(xué)實(shí)驗(yàn)。對(duì)16 sddna序列進(jìn)行了擴(kuò)增，進(jìn)行測(cè)序，并將檢測(cè)到的序列與GenEbank中的細(xì)菌序列進(jìn)行比較。在正常的情況下，同源性在90%以上就可以確定細(xì)菌的屬性，但無法辨別出細(xì)菌的種類。由于本實(shí)驗(yàn)提供了足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在物種鑒定方面具有較高的可靠性。