海參低聚肽和大豆糖肽及其混合物的抗缺氧作用※

許博林，辛元堯，周雪姣，年永瓊，楊 夢，喬一杰，楊建鑫，李向陽

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 青海 西寧 810001)

海參低聚肽是將鮮活的海參經(jīng)過蛋白酶水解、精制后得到的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，以小分子肽為主，具有抗血管生成、抗疲勞、抗炎、抗菌、抗氧化等功能[1，2]；大豆糖肽是按一定比例組成的大豆低聚糖和大豆低聚肽的復(fù)合物，具有影響血管內(nèi)活性物質(zhì)生成、改善血液流和增加機(jī)體免疫等功能[3，4]。本研究旨在探討海參低聚肽和大豆糖肽對(duì)小鼠的抗缺氧作用，為其作為缺氧治療的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

低壓氧艙(DXY300，中行風(fēng)雷公司)、高速離心機(jī)(TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠)、電子天平(BT25S，德國賽多利斯科學(xué)儀器公司)。

1.1.2 試劑

海參低聚肽、大豆糖肽、海參低聚肽與大豆糖肽混合物(大連豪翔生物酶工程有限公司)，紅景天膠囊(四川艾麗碧絲制藥有限公司，批號(hào)：150702)，水為純凈水。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康小鼠[甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：SCXK(甘)2011-0001]，雌雄各半，體重(20±2)g。

1.2 方法

1.2.1 常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 多次給藥

將小鼠隨機(jī)分為11組(每組10只)：對(duì)照組，陽性藥物對(duì)照組，海參低聚肽低、中、高劑量組，大豆糖肽低、中、高劑量組，海參低聚肽+大豆糖肽低、中、高劑量組。藥物溶于水后，給藥組每日灌胃給藥，對(duì)照組給予等容積生理鹽水，連續(xù)給藥10天，每天1次。海參低聚肽低、中、高劑量分別為80、200、500 mg/kg；大豆糖肽低、中、高劑量分別為0.50、1.25、3.00 g/kg；混合物低、中、高劑量分別為0.50、1.25、3.00 g/kg。

1.2.1.2 單次給藥

將小鼠隨機(jī)分為8組(每組10只)：對(duì)照組，陽性藥物對(duì)照組，海參低聚肽低、中、高劑量組和大豆糖肽低、中、高劑量組。藥物溶于水后，給藥組灌胃給藥，對(duì)照組給予等容積生理鹽水，單次給藥。海參低聚肽低、中、高劑量分別為80、200、500 mg/kg；大豆糖肽低、中、高劑量分別為0.50、1.25、3.00 g/kg。

1.2.2 模擬急性高原缺氧實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 多次給藥

將小鼠隨機(jī)分為12組(每組10只)：對(duì)照組，缺氧模型組，陽性藥物對(duì)照組，海參低聚肽低、中、高劑量組，大豆糖肽低、中、高劑量組和海參低聚肽+大豆糖肽低、中、高劑量組。藥物溶于水后，給藥組每日灌胃給藥，對(duì)照組和缺氧模型組給予等容積生理鹽水，連續(xù)給藥10天，每天1次。海參低聚肽低、中、高劑量分別為80、200、500 mg/kg；大豆糖肽低、中、高劑量分別為0.50、1.25、3.00 g/kg；混合物低、中、高劑量分別為0.50、1.25、3.00 g/kg。

1.2.2.2 單次給藥

將小鼠隨機(jī)分為9組(每組10只)，即對(duì)照組，缺氧模型組，陽性藥物對(duì)照組，海參低聚肽低、中、高劑量組，大豆糖肽低、中、高劑量組。藥物溶于水后，給藥組灌胃給藥，對(duì)照組和缺氧模型組分別給予等容積生理鹽水，單次給藥。海參低聚肽低、中、高劑量分別為80、200、500 mg/kg；大豆糖肽低、中、高劑量分別為0.50、1.25、3.00 g/kg。

1.2.3 樣品采集

常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)中，單次給藥和多次給藥末次1天后，將小鼠放入盛有15 g鈉石灰的廣口瓶內(nèi)，用凡士林密封后開始計(jì)時(shí)，以停止呼吸為標(biāo)準(zhǔn)觀察小鼠存活時(shí)間。模擬急性高原缺氧實(shí)驗(yàn)中，單次給藥和多次給藥末次1天后，除空白對(duì)照組外，將其他組小鼠放入低壓氧艙(0.049MPa，相當(dāng)于海拔6000m)，12 小時(shí)后取出小鼠，迅速摘眼球取血，之后斷頭處死取腦組織。采用生化分析儀測定血液中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)和血紅蛋白(HGB)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 常壓密閉缺氧實(shí)驗(yàn)

2.1.1 多次給予海參低聚肽、大豆糖肽和兩者混合物對(duì)小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的影響

末次給藥1天后，將小鼠放入盛有15 g 鈉石灰的廣口瓶內(nèi)，用凡士林密封，計(jì)時(shí)，以停止呼吸為標(biāo)準(zhǔn)觀察小鼠存活時(shí)間，結(jié)果見表1。

Table 1 The survival time of mice under atmospheric pressure treated by sea cucumbers oligopeptides，soybean glycopeptides and mixtures for many

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05.

與空白對(duì)照組比較，多次給予中劑量和高劑量海參低聚肽具有顯著的延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用，分別延長17.22%和23.89%；多次給予中劑量和高劑量大豆糖肽具有顯著的延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用，分別延長17.47%和25.71%；多次給予低劑量、中劑量和高劑量海參低聚肽和大豆糖肽混合物均具有顯著的延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用，分別延長20.12%、26.11%和31.51%。與海參低聚肽和大豆糖肽分別比較，兩者的混合物延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用更強(qiáng)，但無顯著性差異。多次給予高劑量海參低聚肽，高劑量大豆糖肽及低、中、高劑量海參低聚肽和大豆糖肽混合物延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用優(yōu)于陽性對(duì)照藥物紅景天膠囊。

2.1.2 單次給予海參低聚肽和大豆糖肽對(duì)小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的影響

給藥1天后，將小鼠放入盛有15 g鈉石灰的廣口瓶內(nèi)，用凡士林密封，計(jì)時(shí)，以停止呼吸為標(biāo)準(zhǔn)觀察小鼠存活時(shí)間。結(jié)果見表2。

Table 2 The survival time of single dose of sea cucumber oligopeptide and soybean glycopeptide in mice undernormal atmospheric pressure and

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與陽性藥物對(duì)照組比較，P<0.05.

與空白對(duì)照組比較，單次給予高劑量海參低聚肽具有顯著的延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用，延長16.66%；單次給予高劑量大豆糖肽具有顯著的延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用，延長21.03%。單次給予陽性對(duì)照藥物紅景天膠囊沒有抗缺氧的作用，但與陽性藥物對(duì)照組比較，低劑量和大劑量海參低聚肽及高劑量大豆糖肽具有顯著的延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用，提示海參低聚肽和大豆糖肽延長小鼠常壓密閉缺氧存活時(shí)間的作用優(yōu)于紅景天膠囊。

2.2 模擬急性高原缺氧實(shí)驗(yàn)

2.2.1 多次給予海參低聚肽、大豆糖肽和兩者混合物對(duì)模擬6 000 m急性高原缺氧小鼠WBC、RBC和HGB的影響

末次給藥1天后，除空白對(duì)照組外，將其他組小鼠放入低壓氧艙(0.049MPa，相當(dāng)于海拔6000m)模擬高原急性缺氧，12 小時(shí)后取出迅速摘眼球取血，之后斷頭處死取腦組織。采用生化分析儀測定血液中的WBC、RBC和HGB，結(jié)果見表3。

Table 3 Effect of sea cucumber oligopeptide，soybean glycopeptide and their mixture for many times on WBC，RBC and HGB of simulated 6000m acute hypoxia in high altitude in

續(xù)表：

組別nWBC(109/L)RBC(1012/L)HGB(g/L)海參低聚肽和大豆糖肽混合物低劑量組105.01±1.579.27±0.75*142.83±14.47*海參低聚肽和大豆糖肽混合物中劑量組105.32±1.509.83±0.32*140.75±19.41*海參低聚肽和大豆糖肽混合物高劑量組106.01±1.328.86±0.32137.33±7.74*

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05.

與空白對(duì)照組比較，缺氧小鼠血液中的WBC無顯著性變化。與空白對(duì)照組比較，除混合物高劑量組外，其他組小鼠血液中的RBC顯著升高。與缺氧模型組比較，多次給予低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽及低、中混合物均無降低RBC作用；多次給予高劑量海參低聚肽和大豆糖肽混合物具有降低缺氧導(dǎo)致的RBC升高的作用，但與缺氧模型組比較無顯著性差異。與空白對(duì)照組比較，缺氧小鼠血液中的HGB顯著升高；與缺氧模型組比較，低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽及低、中、高混合物均無降低HGB作用。

2.2.2 單次給予海參低聚肽和大豆糖肽對(duì)模擬6 000 m急性高原缺氧小鼠WBC、RBC、HGB的影響

給藥1天后，除空白對(duì)照組外，將其他組小鼠放入低壓氧艙(0.049MPa，相當(dāng)于海拔6000m)模擬高原急性缺氧，12小時(shí)后取出迅速摘眼球取血，之后斷頭處死取腦組織。采用生化分析儀測定血液中的WBC、RBC和HGB，結(jié)果見表4。

Table 4 Effect of single sea cucumber oligopeptide and soybean glycopeptide on WBC，RBC and HGB in simulated 6000m acute hypoxia in

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05.

與空白對(duì)照組比較，缺氧小鼠血液中的WBC無顯著性變化。與空白對(duì)照組比較，模型組，陽性藥物組，低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽組小鼠血液中的RBC顯著升高。與缺氧模型組比較，低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽組小鼠血液中的RBC均無顯著性變化。與空白對(duì)照組比較，模型組，陽性藥物組，低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽組小鼠的HGB顯著升高。與缺氧模型組比較，低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽組小鼠的HGB均無顯著性變化。

2.2.3 多次給予海參低聚肽、大豆糖肽和兩者混合物對(duì)模擬6 000 m急性高原缺氧小鼠LD、LDH、SOD和MDA的影響

末次給藥1天后，除空白對(duì)照組外，將其他組小鼠放入低壓氧艙(0.049MPa，相當(dāng)于海拔6000m)模擬高原急性缺氧，12小時(shí)后取出迅速摘眼球取血，之后斷頭處死取腦組織。按照試劑盒說明采用ELISA法測定腦組織中的乳酸(LD)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)，結(jié)果見表5。

Table 5 Effect of treated for many times by sea cucumber oligopeptide，soybean glycopeptide and their mixtureon LD，LDH，SOD and MDA of simulated 6000m acute hypoxia in high altitude in

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05.

與空白對(duì)照組比較，缺氧模型組小鼠腦組織內(nèi)LD、MDA含量和LDH活性明顯升高，SOD活性顯著降低。與缺氧模型組比較，多次給予低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽及低、中、高混合物組小鼠腦組織內(nèi)LD、MDA含量和LDH活性顯著降低，SOD活性明顯升高。低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽及低、中、高混合物組之間均無顯著性差異。

2.2.4 單次給予海參低聚肽、大豆糖肽和兩者混合物對(duì)模擬6 000 m急性高原缺氧小鼠LD、LDH、SOD和MDA的影響

給藥1天后，除空白對(duì)照組外，將其他組小鼠放入低壓氧艙(0.049MPa，相當(dāng)于海拔6000m)模擬高原急性缺氧，12小時(shí)后取出迅速摘眼球取血，之后斷頭處死取腦組織。按照試劑盒說明采用ELISA法測定腦組織中的LD、LDH、SOD和MDA，結(jié)果見表6。

Table 6 Effect of treated for single time by sea cucumber oligopeptide，soybean glycopeptide and mixture in mice onLD，LDH，SOD and MDA of simulated 6000m acute high altitude

續(xù)表：

組別nLD(mmoL/L)LDH(U/L)SOD(U/mL) MDA(nmoL/mL)海參低聚肽中劑量組101.88±1.00729.38±62.12103.89±8.602.05±0.34海參低聚肽高劑量組101.67±0.63713.07±112.69102.07±22.292.08±0.61大豆糖肽低劑量組101.73±0.31732.64±80.19107.44±17.212.22±0.55大豆糖肽中劑量組101.69±0.30708.99±78.06104.34±28.692.19±0.25大豆糖肽高劑量組101.63±0.49703.28±55.99105.39±23.762.03±0.18

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05.

與空白對(duì)照組比較，缺氧模型組小鼠腦組織內(nèi)LD、MDA含量和LDH活性明顯升高，SOD活性顯著降低。與缺氧模型組比較，單次給予低、中、高海參低聚肽和低、中、高大豆糖肽組小鼠腦組織內(nèi)LD、MDA含量和LDH、SOD活性均無顯著性變化。

3 討論

人在高原、高空、潛水等特殊環(huán)境下工作或訓(xùn)練，罹患缺氧性疾病，如肺心病、成人呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺疾患、慢性高原病時(shí)機(jī)體極易受到缺氧的損害。金雪蓮[5]紅景天苷不僅對(duì)常壓缺氧和高壓缺氧小鼠有保護(hù)作用，而且對(duì)特異性心肌缺氧以及亞硝酸鈉中毒小鼠均能明顯延長生存時(shí)間。紅景天苷是藏藥紅景天的主要活性成分，能夠提高機(jī)體對(duì)氧氣的利用率，具有良好的抗缺氧損傷保護(hù)作用及清除自由基的活性作用[6]。高元峰[7]等通過大鼠離體心臟建立缺血-再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)紅景天苷能降低梗死面積，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，對(duì)缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用。De-La-Torre P[8]等通過低氧誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠阻止由低氧誘導(dǎo)的線粒體依賴的凋亡通路對(duì)小鼠心肌細(xì)胞造成的損傷。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多次給予海參低聚肽、大豆糖肽及海參低聚肽和大豆糖肽混合物均能夠顯著延長缺氧小鼠的生存時(shí)間，增加小鼠對(duì)于缺氧的抵抗力，效果均優(yōu)于陽性對(duì)照藥物紅景天膠囊。而且缺氧情況下均能夠顯著提高腦組織SOD活性，提高LD的代謝能力，降低LD的堆積，防止膜脂質(zhì)過氧化，具有顯著提高小鼠缺氧耐受的作用，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。