低出生重對(duì)仔豬免疫功能的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

田一航 陳代文 余 冰 何 軍 虞 潔 毛湘冰 羅玉衡 黃志清 羅鈞秋 鄭 萍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安625014)

遺傳育種技術(shù)的發(fā)展和飼養(yǎng)管理的改善雖然提高了母豬的窩產(chǎn)仔數(shù)，但是也提高了低出生重仔豬數(shù)量[1]，自然發(fā)生的低出生重仔豬比例高達(dá)15%～20%[2-3]。低出生重顯著提高仔豬斷奶前死亡率和發(fā)育不良比例[4]，造成飼養(yǎng)管理所投入的精力和資本增加。宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)即哺乳動(dòng)物妊娠期胚胎或胎兒發(fā)育受阻，是低出生重仔豬產(chǎn)生的主要原因[2,5]。前人研究表明，與正常出生重仔豬相比，IUGR仔豬胸腺雙陽(yáng)性(CD4+CD8+)細(xì)胞占總T細(xì)胞的比例[6]、外周血淋巴細(xì)胞對(duì)脂多糖(LPS)和刀豆素A(ConA)刺激的反應(yīng)[7]和血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量[8-9]均顯著降低。

精氨酸是幼齡哺乳動(dòng)物所必需的氨基酸，在體內(nèi)既參與蛋白質(zhì)的合成，又是一氧化氮、多胺、肌酸和胍丁胺合成的前體[10]。哺乳仔豬7～14日齡，血液循環(huán)中精氨酸及其前體瓜氨酸、鳥氨酸的含量顯著降低[11-12]。前人研究表明，單頭7日齡的哺乳仔豬每天精氨酸的需要量為2.7 g，而豬乳只能提供1.06 g[13-14]。Kim等[15]在哺乳仔豬配方乳中添加精氨酸，顯著提高了仔豬血漿精氨酸含量和生長(zhǎng)性能。精氨酸在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，正常條件下，飼糧添加0.2%和0.8%精氨酸使14日齡仔豬脾臟指數(shù)分別提高32%和14%，飼糧添加0.6%精氨酸使其胸腺指數(shù)提高150%[16]。免疫抑制條件下，飼糧添加精氨酸顯著提高了仔豬脾臟和胸腺指數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞比例、血清IgA含量和干擾素-γ(IFN-γ)表達(dá)量[17-18]。免疫激活條件下，飼糧添加精氨酸顯著降低仔豬血清IFN-γ和白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量和肝臟腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，抑制Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路的過度激活[19-20]。

低出生重影響仔豬免疫功能，而精氨酸在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。因此本試驗(yàn)通過比較低出生重仔豬和正常出生重仔豬的免疫功能，并在飼糧中添加精氨酸飼喂低出生重仔豬，考察精氨酸添加對(duì)低出生重仔豬的免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用仔豬從72頭體況接近、胎次相近和產(chǎn)期一致的母豬所產(chǎn)“杜×長(zhǎng)×大”新生仔豬中選取。根據(jù)前人研究[21-22]確定選擇標(biāo)準(zhǔn)，首先標(biāo)記出16頭1.4～1.6 kg的正常出生重仔豬和72頭0.8～1.0 kg的低出生重仔豬。4日齡時(shí)，再按照體重接近和性別比例一致的原則從標(biāo)記過的仔豬中選取30頭仔豬，包括10頭正常出生重仔豬和20頭低出生重仔豬，正常出生重仔豬飼喂基礎(chǔ)飼糧(Ⅰ組)，10頭低出生重仔豬飼喂基礎(chǔ)飼糧(Ⅱ組)，另外10頭低出生重仔豬飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加1.0%L-精氨酸的試驗(yàn)飼糧(Ⅲ組)，人工乳飼喂21 d。

1.2 試驗(yàn)材料

L-精氨酸由日本味之素公司提供，純度為99%，L-丙氨酸由上海易蒙斯公司提供，純度為99%。

1.3 試驗(yàn)飼糧

飼糧為人工乳，由代乳粉加水配制而成，按照代乳粉∶水=1∶4的比例加40 ℃溫開水，充分溶解混勻后飼喂。基礎(chǔ)飼糧參考前人研究[23-24]配制，精氨酸組(Ⅲ組)飼糧添加1.0%的L-精氨酸，此添加量根據(jù)本課題組前期研究確定，通過添加葡萄糖和L-丙氨酸使2種飼糧等能等氮，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content總色氨酸 Total Trp0.61總纈氨酸 Total Val1.54

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供 The vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 0.94 mg，VD30.01 mg，VE 20 mg，VK31 mg，VB11.5 mg，VB20.1 mg，生物素 biotin 2 mg，VB62 mg，VB120.04 mg，煙酸 nicotinic acid 20 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 15 mg，葉酸 folic acid 1.5 mg。

2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (as ferrous sulfate) 100 mg，Cu (as copper sulfate) 10 mg，Mn (as ferrous sulfate) 5 mg，Zn (as zinc sulfate) 100 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg，I (as potassium iodide ) 0.2 mg。

3)消化能、粗蛋白質(zhì)、鈣和有效磷為計(jì)算值，氨基酸為實(shí)測(cè)值。DE, CP, Ca and AP were calculated values, while amino acids were measured values.

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所科研基地進(jìn)行，所有仔豬單籠飼養(yǎng)于代謝籠中。試驗(yàn)前對(duì)圈舍及代謝籠進(jìn)行全面消毒，試驗(yàn)第1周溫度控制在31～32 ℃，之后每周降低2 ℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%。每天飼喂時(shí)間為06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00和24:00，每次以仔豬吃飽為準(zhǔn)，并記錄采食量，計(jì)算干物質(zhì)采食量。試驗(yàn)期間不對(duì)豬只使用任何抗生素類藥物，其余按基地要求進(jìn)行操作管理。

1.5 樣品采集與處理

在正式試驗(yàn)的第22天清晨，對(duì)各組仔豬進(jìn)行稱重，記錄末重。

1.5.1 血液樣品采集

在正式試驗(yàn)的第22天清晨稱重結(jié)束后，對(duì)各組仔豬進(jìn)行空腹采血，將采集的前腔靜脈血液緩慢倒入玻璃采血管中，3 500 r/min離心15 min制備血清，取吸上清液，做好標(biāo)記后分裝，置于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.5.2 臟器稱重

血液樣品采集結(jié)束后，對(duì)仔豬進(jìn)行麻醉屠宰。屠宰后，迅速打開仔豬腹腔，分離出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺以及腹股溝淋巴結(jié)，然后小心剔除臟器表面異物并用濾紙吸去臟器表面的血漬，使用電子秤進(jìn)行稱重。

1.5.3 組織樣品采集

臟器稱重后，分別取脾臟和胸腺組織裝于凍存管中，錫箔紙包好，投入液氮速凍，并放入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.6.1 生長(zhǎng)性能

根據(jù)仔豬初始體重、干物質(zhì)采食量和末重計(jì)算平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)，并計(jì)算料重比(F/G)。

1.6.2 臟器指數(shù)

使用電子秤對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺和腹股溝淋巴結(jié)稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(g/kg)=臟器重量(g)/體重(kg)。

1.6.3 血清IgA、IgG和IgM含量

采用上海鑫樂生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.6.4 脾臟和胸腺基因表達(dá)測(cè)定

實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定脾臟和胸腺細(xì)胞因子基因[包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IFN-γ和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)]、免疫相關(guān)基因[包括Toll樣受體2(TLR2)、TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)]和精氨酸代謝基因[包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、精氨酸酶1(ARG1)和精氨酸酶2(ARG2)]相對(duì)表達(dá)量。

總RNA的提取按照試劑盒(Trizol Reagent,TaKaRa,日本)操作說明進(jìn)行，RNA質(zhì)量檢測(cè)使用核酸蛋白檢測(cè)儀(Beckman DU-800,CA,美國(guó))于260 nm檢測(cè)，A260/A280表示RNA的純度，該比值在1.8～2.0說明RNA純度較好。cDNA的合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMregent kit,TaKaRa,日本)，反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存待用。利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)搜索基因序列，運(yùn)用Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表2。用實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI7900HT Real-Time PCR System,ABI,美國(guó))進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)熒光染料為SYBR Green Ⅰ (TaKaRa,日本)。反應(yīng)體系為10.0 μL：5.0 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、3.0 μL雙蒸水和1.0 μL cDNA模板。通過對(duì)3個(gè)常用內(nèi)參基因[β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和18S核糖體RNA(18S rRNA)]的篩選，分別選擇β-actin和GAPDH作為脾臟和胸腺的內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列及參數(shù)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)首先用Excel 2010進(jìn)行初步整理，然后使用SPSS 21.0軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩兩比較，Ⅱ組與Ⅰ組比較的顯著性用P1表示，Ⅲ組與Ⅱ組比較的顯著性用P2表示，Ⅲ組與Ⅰ組比較的顯著性用P3表示，以P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié) 果

2.1 低出生重對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

如表3所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組和Ⅲ組仔豬末重、ADG、ADFI和F/G顯著降低(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬末重、ADG和ADFI顯著提高(P<0.05)，F(xiàn)/G有降低的趨勢(shì)(P=0.07)。

表3 低出生重對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

2.2 低出生重對(duì)仔豬臟器指數(shù)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

如表4所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺和腹股溝淋巴結(jié)指數(shù)無顯著差異(P>0.10)，Ⅲ組仔豬胸腺指數(shù)和腹股溝淋巴結(jié)指數(shù)顯著提高(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)，胸腺指數(shù)有提高的趨勢(shì)(P=0.07)。

表4 低出生重對(duì)仔豬臟器指數(shù)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

2.3 低出生重對(duì)仔豬血清免疫球蛋白含量的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

如表5所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬血清IgG含量顯著降低(P<0.05)，Ⅲ組仔豬血清IgA和IgM含量顯著提高(P<0.05)，Ⅲ組仔豬血清IgG含量顯著降低(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬血清IgA含量顯著提高(P<0.05)，血清IgM含量有提高趨勢(shì)(P=0.05)。

2.4 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

如表6所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬脾臟IL-10、TNF-α和TGF-β1表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Ⅲ組仔豬脾臟IFN-γ表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，Ⅲ組仔豬脾臟TGF-β1表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組仔豬胸腺IL-2表達(dá)量有提高的趨勢(shì)(P=0.08)，Ⅲ組仔豬胸腺IL-10表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Ⅲ組仔豬胸腺IL-1β(P=0.08)和IL-6表達(dá)量(P=0.08)有降低的趨勢(shì)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟IFN-γ表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，胸腺IL-10表達(dá)量(P=0.06)和TGF-β1表達(dá)量(P=0.09)有降低的趨勢(shì)。

表5 低出生重對(duì)仔豬血清免疫球蛋白含量的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

表6 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

2.5 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

如表7所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬脾臟TLR2、NF-κB、p38MAPK和MyD88的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Ⅲ組仔豬脾臟NF-κB表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組仔豬胸腺p38MAPK和MyD88表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組仔豬胸腺NF-κB表達(dá)量有降低的趨勢(shì)(P=0.09)，Ⅲ組仔豬胸腺TLR4、NF-κB、p38MAPK和MyD88表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟p38MAPK表達(dá)量有提高的趨勢(shì)(P=0.08)，胸腺TLR4表達(dá)量有降低的趨勢(shì)(P=0.06)。

2.6 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺精氨酸代謝基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

如表8所示，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬脾臟iNOS表達(dá)量有降低的趨勢(shì)(P=0.07)，Ⅱ組仔豬脾臟ARG1表達(dá)量有提高的趨勢(shì)(P=0.09)，Ⅲ組仔豬脾臟iNOS(P=0.08)和ARG2(P=0.07)表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，Ⅱ組仔豬胸腺ARG2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組仔豬胸腺iNOS表達(dá)量有降低的趨勢(shì)(P=0.07)，Ⅲ組仔豬胸腺iNOS、ARG1和ARG2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Ⅲ組仔豬胸腺eNOS表達(dá)量有降低的趨勢(shì)(P=0.06)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟和胸腺iNOS、eNOS、ARG1和ARG2表達(dá)量無顯著差異(P>0.10)。

表7 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

表8 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺精氨酸代謝基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

3 討 論

3.1 低出生重對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

低出生重導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)性能下降，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來負(fù)面影響。He等[23]研究結(jié)果表明，與正常出生重仔豬相比，IUGR仔豬21日齡斷奶體重和ADG顯著降低。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬末重、ADG、ADFI和F/G顯著降低，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明低出生重降低仔豬生長(zhǎng)性能。精氨酸是幼齡哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)的必需氨基酸，研究發(fā)現(xiàn)豬乳中精氨酸含量較低[13]，單頭7日齡的仔豬每天精氨酸需要量為2.7 g，而豬乳只能提供1.06 g[14]。哺乳仔豬7～14日齡期間血液循環(huán)中精氨酸及其前體瓜氨酸、鳥氨酸的含量顯著降低[11-12]，Kim等[15]在哺乳仔豬配方乳中添加適量精氨酸，顯著提高了仔豬血漿精氨酸含量和生長(zhǎng)性能。Wang等[22]在7日齡IUGR仔豬飼糧中添加0.6%精氨酸，顯著提高了IUGR仔豬的生長(zhǎng)性能。本研究結(jié)果表明，與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬末重、ADG和ADFI顯著提高，F(xiàn)/G有降低的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明精氨酸可以促進(jìn)低出生重仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅲ組仔豬末重、ADG和ADFI顯著降低，說明本研究中，飼糧精氨酸添加還未能使低出生重仔豬生長(zhǎng)性能達(dá)到正常出生重仔豬的水平。

3.2 低出生重對(duì)仔豬臟器指數(shù)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

仔豬臟器指數(shù)是其主要的生物學(xué)特性指標(biāo)之一，該指標(biāo)的高低一定程度上可以反映其功能的大小。Wiyaporn等[25]研究結(jié)果表明，與同日齡的正常出生重仔豬相比，初生和7日齡的低出生重仔豬肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)均無顯著差異。Hu等[8]研究結(jié)果表明，28日齡的IUGR仔豬與正常出生重仔豬相比，心臟、肝臟、脾臟和腎臟指數(shù)無顯著差異。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺和腹股溝淋巴結(jié)指數(shù)無顯著差異，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明低出生重對(duì)仔豬臟器發(fā)育無顯著影響。Tan等[16]研究表明，飼糧添加0.2%和0.8%精氨酸使14日齡仔豬脾臟指數(shù)分別提高32%和14%，飼糧添加0.6%精氨酸使其胸腺指數(shù)提高150%。本研究結(jié)果表明，與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟指數(shù)顯著提高，胸腺指數(shù)有提高的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明精氨酸促進(jìn)低出生重仔豬脾臟和胸腺的發(fā)育。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅲ組仔豬胸腺指數(shù)和腹股溝淋巴結(jié)指數(shù)顯著提高，說明本研究中，飼糧添加精氨酸使低出生重仔豬胸腺發(fā)育達(dá)到了正常出生重仔豬的水平。

3.3 低出生重對(duì)仔豬血清免疫球蛋白含量的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

血清免疫球蛋白是介導(dǎo)仔豬體液免疫的主要抗體，其中IgG含量最高。鐘翔[9]研究結(jié)果表明，7日齡IUGR仔豬與正常出生重仔豬相比，血清IgG含量降低20.8%。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬血清IgG含量顯著降低，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明低出生重降低仔豬體液免疫功能。精氨酸添加量影響低出生重仔豬血清免疫球蛋白的分泌。范苗[26]研究結(jié)果表明，飼糧每天添加250、375和500 mg/kg精氨酸使21日齡仔豬血清IgA含量分別提高33.33%、58.10%和33.33%，僅有每天添加250 mg/kg精氨酸使血清IgG含量提高17.68%。Tan等[16]研究結(jié)果表明，飼糧添加0.6%～0.8%精氨酸使14日齡仔豬血清IgM含量提高150%～200%，添加0.4%～0.8%精氨酸使21日齡仔豬血清IgM含量提高62%～91%；僅有添加0.2%精氨酸使21日齡仔豬血清IgG含量提高12%，高于0.2%的添加量不能使其進(jìn)一步提高。本研究結(jié)果表明，與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬血清IgA含量顯著提高，血清IgM含量有提高趨勢(shì)，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明精氨酸通過促進(jìn)免疫球蛋白的分泌，提高仔豬體液免疫功能，但精氨酸的最佳添加量有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅲ組仔豬血清IgA和IgM含量顯著提高，血清IgG含量顯著降低，說明本研究中，飼糧添加精氨酸使低出生重仔豬血清IgA和IgM含量達(dá)到了正常出生重仔豬的水平。

3.4 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

細(xì)胞因子主要是由免疫細(xì)胞[如單核、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及自然殺傷(NK)細(xì)胞等]經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，是免疫系統(tǒng)重要的組成部分。TNF-α由肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞分泌，可募集嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)對(duì)病原體的清除能力[27-28]。IL-10由Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞這3種免疫細(xì)胞分泌[29]，具有抑制Th1細(xì)胞活化的作用[30]。TGF-β1由T細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，具有干預(yù)naive T細(xì)胞的分化，抑制巨噬細(xì)胞激活和效應(yīng)性T細(xì)胞增殖，降低促炎細(xì)胞效應(yīng)的作用[31]。IL-2主要由Th1細(xì)胞分泌，具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活化的功能[32]。有研究結(jié)果表明，與同日齡正常出生重仔豬相比，初生IUGR仔豬血清IL-10含量顯著降低，血清TNF-α含量有降低的趨勢(shì)，回腸TNF-α含量以及IL-10和TNF-α表達(dá)量顯著降低[33]，7和21日齡IUGR仔豬血清IL-10含量顯著降低[7,27]。也有研究結(jié)果表明，與同日齡正常出生重仔豬相比，初生IUGR仔豬結(jié)腸IL-6基因表達(dá)量顯著提高[28]，19日齡IUGR仔豬小腸近端TNF-α表達(dá)量顯著提高[34]。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬脾臟IL-10、TNF-α和TGF-β1的表達(dá)量顯著降低，胸腺IL-2表達(dá)量有提高的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明低出生重影響仔豬細(xì)胞因子的表達(dá)，但在不同組織所得到的結(jié)果會(huì)有不同。仔豬脾臟和胸腺富含T細(xì)胞，T細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，對(duì)細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)也具有重要的作用。林燕等[6]研究結(jié)果表明，與正常出生重仔豬相比，1日齡IUGR仔豬CD4+CD8+T細(xì)胞(雙陽(yáng)性細(xì)胞)占胸腺總T細(xì)胞的比例顯著低于正常出生重仔豬。Dong等[33]研究結(jié)果表明，與初生正常出生重仔豬相比，IUGR仔豬血液中的CD4/CD8值顯著降低，脾臟CD8水平顯著提高，胸腺CD4表達(dá)量顯著提高。目前關(guān)于低出生重仔豬脾臟和胸腺T細(xì)胞的研究較少，細(xì)胞因子分泌異常與T細(xì)胞的關(guān)系需要進(jìn)一步的研究。曲紅焱[17]研究結(jié)果表明，飼糧添加精氨酸提高環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的仔豬血清IFN-γ含量的降低。韓杰[18]研究結(jié)果表明，飼糧添加精氨酸顯著改善環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的仔豬血中白細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞比例和IFN-γ含量的降低。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，能夠激活巨噬細(xì)胞，具有高度生物學(xué)活性，且具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，IFN-γ基因在轉(zhuǎn)錄水平受到嚴(yán)格的調(diào)控[35]。本研究結(jié)果表明，與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟IFN-γ表達(dá)量顯著提高，胸腺IL-10和TGF-β1表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明飼糧添加精氨酸改善了低出生重仔豬脾臟細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟IFN-γ表達(dá)量顯著提高，TGF-β1表達(dá)量顯著降低，胸腺IL-10表達(dá)量顯著降低，胸腺IL-1β和IL-6表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，說明本研究中，飼糧添加精氨酸改善了低出生重仔豬脾臟IFN-γ和胸腺IL-2的表達(dá)。

3.5 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

Toll樣受體是一類模式識(shí)別受體，可以識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，并激活NF-κB和MAPK信號(hào)途徑，在機(jī)體的免疫防御中發(fā)揮重要的作用。TLR2是Toll樣受體中的一種，可識(shí)別肽聚糖、脂肽和脂蛋白等病原相關(guān)分子模式，還可以與其他Toll樣受體形成異源二聚體識(shí)別TLR2的配體，屬于MyD88依賴型，TLR2識(shí)別其配體后，胞內(nèi)區(qū)Toll樣受體與接頭分子MyD88結(jié)合，并與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)等分子相互作用，激活NF-κB，引起多種與免疫有關(guān)的細(xì)胞因子分泌，如IL-2、TNF-α和IFN-γ等[36]。p38 MAPK屬于MAPK家族，活化的p38 MAPK可激活轉(zhuǎn)錄激活因子-2(ATF-2)、活化T細(xì)胞核因子(NF-AT)及NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)IFN-γ的分泌[37]。Zhong等[7]研究結(jié)果表明，與正常出生重仔豬相比，7日齡IUGR仔豬空腸和回腸NF-κB蛋白含量顯著降低。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬脾臟TLR2、NF-κB、MyD88和p38MAPK表達(dá)量顯著降低，胸腺p38MAPK和MyD88表達(dá)量顯著降低，胸腺NF-κB表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明低出生重仔豬脾臟和胸腺NF-κB和p38 MAPK信號(hào)途徑受損。精氨酸可以調(diào)節(jié)免疫相關(guān)信號(hào)途徑，改善仔豬免疫功能。Chen等[19]研究結(jié)果表明，仔豬飼糧添加精氨酸抑制脾臟、肝臟、腹股溝淋巴結(jié)TLR4-MyD88信號(hào)通路的過度激活緩解免疫應(yīng)激。Li等[20]研究結(jié)果表明，飼糧添加精氨酸抑制肝臟TLR4-NF-κB信號(hào)途徑，緩解大腸桿菌造成的損傷。本研究結(jié)果表明，與Ⅱ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟p38MAPK表達(dá)量有提高的趨勢(shì)，胸腺TLR4表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明精氨酸對(duì)低出生重仔豬脾臟和胸腺免疫相關(guān)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，但是否可以通過提高p38MAPK表達(dá)量改善低出生重仔豬脾臟免疫功能，有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟NF-κB表達(dá)量顯著降低，胸腺TLR4、NF-κB、p38MAPK和MyD88表達(dá)量顯著降低，說明本研究中，飼糧添加精氨酸使低出生重仔豬脾臟TLR2、TLR2、MyD88和p38MAPK表達(dá)量達(dá)到了正常出生重仔豬的水平。

3.6 低出生重對(duì)仔豬脾臟和胸腺精氨酸代謝基因表達(dá)的影響及精氨酸的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)

一氧化氮是一種重要的內(nèi)源性信使分子，參與體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)。精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)的作用下生成一氧化氮，是體內(nèi)一氧化氮生成的唯一途徑[38]。NOS有2種重要的亞型，其中eNOS參與生理水平一氧化氮的生成，細(xì)菌內(nèi)毒素、IL-1β及TNF-α等可誘導(dǎo)iNOS的生成，產(chǎn)生大量的一氧化氮[39]。精氨酸酶催化精氨酸生成鳥氨酸和尿素，是體內(nèi)另外一條利用精氨酸的途徑，精氨酸酶可競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS的活性[39]。精氨酸酶有2種亞型，ARG1主要在肝臟中表達(dá)而ARG2在多種組織有不同程度的表達(dá)[40]。NOS和精氨酸酶受到Th1和Th2型細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，Th1型細(xì)胞因子誘導(dǎo)NOS的表達(dá)，Th2型細(xì)胞因子誘導(dǎo)精氨酸酶的表達(dá)[39]。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅱ組仔豬脾臟iNOS表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，脾臟ARG1表達(dá)量有升高的趨勢(shì)，胸腺iNOS表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，胸腺ARG2表達(dá)量顯著降低，說明低出生重降低了仔豬胸腺對(duì)精氨酸的催化利用。飼糧添加精氨酸可以調(diào)節(jié)精氨酸在體內(nèi)的代謝過程[41-42]。Huang等[43]研究結(jié)果表明，飼糧添加0.8%精氨酸顯著提高14日齡仔豬十二指腸黏膜一氧化氮含量和21日齡仔豬空腸黏膜NOS活性和血漿鳥氨酸含量；飼糧添加0.4%精氨酸顯著提高21日齡仔豬血漿鳥氨酸含量和空腸黏膜精胺含量。本研究結(jié)果表明，與低出生重仔豬相比，飼糧添加精氨酸對(duì)仔豬脾臟和胸腺ARG1、ARG2、iNOS和eNOS表達(dá)量均無顯著影響，本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果不一致，原因可能是添加劑量、添加時(shí)間以及試驗(yàn)條件的不同。本研究結(jié)果表明，與Ⅰ組相比，Ⅲ組仔豬脾臟iNOS和ARG2表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，胸腺iNOS、ARG1和ARG2表達(dá)量顯著降低，胸腺eNOS表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，說明本研究中，飼糧添加精氨酸未能改善低出生重仔豬胸腺精氨酸代謝基因表達(dá)。

4 結(jié) 論

① 與正常出生重仔豬相比，低出生重仔豬生長(zhǎng)性能顯著降低，血清IgG含量顯著降低，脾臟IL-10、TNF-α、TGF-β1、TLR2、NF-κB、p38MAPK和MyD88表達(dá)量顯著降低，胸腺p38MAPK、MyD88和ARG2表達(dá)量顯著降低。

② 飼糧添加1.0%精氨酸顯著提高了低出生重仔豬生長(zhǎng)性能、血清IgA含量、脾臟指數(shù)和脾臟IFN-γ表達(dá)量。

③ 飼糧添加1.0%精氨酸有改善低出生重仔豬免疫功能的作用，部分指標(biāo)可達(dá)到正常出生重仔豬的水平。