豬大腸桿菌的分離鑒定及其藥敏試驗(yàn)

陳敏卿 龍巖市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心 福建龍巖 364000

豬大腸桿菌病是由豬致病性大腸桿菌引起的，臨床上主要引起仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，在我國(guó)各地均有發(fā)生，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。隨著生豬規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展及抗生素的大量使用，同時(shí)又因大腸桿菌其血清型眾多，抗原復(fù)雜，具有容易產(chǎn)生變異等特性，大腸桿菌菌株已產(chǎn)生廣泛的耐藥性和多重耐藥性。因此，本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)菌的分離鑒定，并篩選其敏感藥物，從而有效的指導(dǎo)臨床用藥，達(dá)到最佳的治療效果。

1 材 料

1.1 病料及來(lái)源 病料來(lái)源于福建省某規(guī)?；i場(chǎng)疑似發(fā)生大腸桿菌病的仔豬，無(wú)菌采集豬淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、腸內(nèi)容物、腸系膜淋巴結(jié)等病料。

1.2 材料及試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)置廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏紙片購(gòu)置北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；DNA提取試劑盒、2×EasyTaq PCR Super-Mix等試劑購(gòu)置全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠購(gòu)置吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方 法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鏡檢 將病料接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18～24 h，將可疑的大腸桿菌菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃恒溫箱中純化培養(yǎng)12～18 h。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，置于顯微鏡下觀察鏡檢。

2.2 測(cè)序鑒定 選用通用引物27F/1492R擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA。 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'，1492R：5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min、94 ℃變性 40 s、52 ℃復(fù)性 40 s、72 ℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和克隆，送往生工（上海）生物工程有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，將測(cè)序的結(jié)果與GenBank中公布的序列進(jìn)行同源性分析。

2.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[4]，將待檢的菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18 h，細(xì)菌計(jì)數(shù)后，將菌液稀釋成1010CFU/mL。10只昆明小鼠隨機(jī)分成2組，試驗(yàn)組腹腔接種0.3 mL菌液，對(duì)照組腹腔注射等劑量的生理鹽水，隔離飼養(yǎng)，觀察小白鼠死亡情況。

2.4 藥敏試驗(yàn) 采用K-B藥敏紙片紙法，將純化的菌落涂布于瓊脂平板上，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果，并根據(jù)抑菌環(huán)直徑來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié) 果

3.1 細(xì)菌的分離與鏡檢 經(jīng)培養(yǎng)，在普通瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)灰白色、稍隆起、圓形、濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊的中等大小菌落（直徑2～3 mm）；在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出磚紅色、光滑、濕潤(rùn)、圓形隆起、邊緣整齊的菌落。革蘭染色結(jié)果為中等大小、兩端鈍圓、散在排列、無(wú)芽孢，革蘭陰性桿菌（見(jiàn)圖1）。

3.2 序列測(cè)定及鑒定 分離的細(xì)菌PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠瓊脂電泳，出現(xiàn)預(yù)期的特異性條帶 （見(jiàn)圖2）。將測(cè)序結(jié)果采用Bioedit軟件參照正反向序列圖譜對(duì)序列進(jìn)行人工校對(duì)，然后輸入Genbank用Blastn軟件進(jìn)行相似性比較，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的細(xì)菌與GenBank中公布的大腸桿菌16S rRNA序列同源性高達(dá)99.9%以上，確定分離的細(xì)菌為大腸桿菌。

圖1 革蘭染色結(jié)果

圖2 豬大腸桿菌16S rRNA基因PCR結(jié)果

3.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果 小鼠攻毒后24 h后，試驗(yàn)組的5只小鼠全部死亡，而對(duì)照組無(wú)出現(xiàn)死亡。試驗(yàn)組的發(fā)病小鼠出現(xiàn)精神沉郁、低頭昏睡、體溫升高、采食量大幅減少、腹瀉、呼吸加快。剖檢死亡小鼠可見(jiàn)肝臟腫大，有出血點(diǎn)和壞死點(diǎn)，心包淤血，腸道炎癥膨脹，腸腔內(nèi)充滿水樣稀便，說(shuō)明本試驗(yàn)分離的大腸桿菌具有一定的致病性。

3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 瓊脂平板經(jīng)24 h培養(yǎng)，用直尺測(cè)量藥敏紙片的抑菌圈直徑，分析該分離菌的藥物敏感藥物（見(jiàn)表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)該分離菌只對(duì)丁胺卡那和頭孢喹肟敏感，而對(duì)慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、強(qiáng)力霉素、磺胺嘧啶鈉和林可霉素都存在不同程度的耐藥性。

4 討 論

1）豬大腸桿菌病在全世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，在我國(guó)廣泛流行，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。病豬主要表現(xiàn)為腹瀉、漿膜性水腫等腸道癥狀，嚴(yán)重影響仔豬的健康，死亡率提高[5]。本研究通過(guò)對(duì)細(xì)菌的分離，并通過(guò)革蘭染色鏡檢、PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序鑒定，明確了本試驗(yàn)分離的細(xì)菌為豬大腸桿菌。同時(shí)，小鼠毒力實(shí)驗(yàn)表明該試驗(yàn)分離的豬大腸桿菌具有一定的致病性。

表1 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

2）目前，細(xì)菌的鑒定方法主要包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法兩大類，表型鑒定法主要是對(duì)細(xì)菌形態(tài)和生理生化進(jìn)行鑒定，而分子遺傳學(xué)鑒定法是核酸水平的鑒定。生理生化表型鑒定常出現(xiàn)不穩(wěn)定、敏感性不高、測(cè)試項(xiàng)目多、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等問(wèn)題。本試驗(yàn)先通過(guò)表型的細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察初步確定細(xì)菌的種類，再通過(guò)PCR和16S rRNA序列測(cè)定，從分子遺傳學(xué)水平對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)一步鑒定，快速、準(zhǔn)確的從細(xì)菌的表型水平再到分子遺傳學(xué)水平對(duì)該分離菌進(jìn)行了鑒定，確保了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。

3）豬大腸桿菌病感染后，使用敏感抗生素具有一定的效果，但大腸桿菌由于其血清型眾多，抗原復(fù)雜，又具有容易產(chǎn)生變異的特性[6]和長(zhǎng)期使用同類抗生素會(huì)造成細(xì)菌的耐藥性，導(dǎo)致治療困難。所以臨床上有必要對(duì)發(fā)病的豬場(chǎng)進(jìn)行分離鑒定并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，從而指導(dǎo)臨床生產(chǎn)用藥和防治。本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)表明分離的豬大腸桿菌對(duì)慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、強(qiáng)力霉素、磺胺嘧啶鈉、林可霉素都表現(xiàn)為耐藥性，只有對(duì)丁胺卡那和頭孢喹肟敏感，說(shuō)明本試驗(yàn)分離的大腸桿菌株具有多重耐藥的特性，給生產(chǎn)上的治療帶來(lái)了巨大的困難。