轉(zhuǎn)移因子對(duì)豬淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率影響的測(cè)試研究

徐 磊 薛 萍 林祚貴 劉俊斌 譚禮寧 劉小龍王曉斌 葉盛聰 楊 慧 黃 瑜 朱國(guó)強(qiáng)＊

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福州 350119；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇揚(yáng)州 225009；3.派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500；4.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

轉(zhuǎn)移因子（Transfer Factor，TF）是白細(xì)胞內(nèi)可透析、具有生物活性的非均一小分子混合物，是一種細(xì)胞因子。其成分復(fù)雜，主要含有多肽和核糖，以及多種游離氨基酸和 Na、Mg、K、Ca、Zn 等金屬元素[1-6]。TF是具有特異和非特異性免疫活性的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，可特異或非特異的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體免疫水平，是一種新型、有效、安全的免疫調(diào)節(jié)制劑[7-10]。

試驗(yàn)按照本課題組已獲授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利制備TF[11-13]，通過肌肉注射TF研究其對(duì)豬淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率的影響，揭示TF發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用的一些機(jī)理，為獸用TF的臨床應(yīng)用提供相關(guān)試驗(yàn)參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉、葡萄糖、碳酸氫鈉、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、姬姆薩染料和臺(tái)盼藍(lán)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊二醛、甘油和甲醇均購(gòu)自西隴化工股份有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；光學(xué)顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品，型號(hào)ECLIPSE E100。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 同窩健康檢驗(yàn)用仔豬12頭，均于20日齡斷乳，斷乳后于全排風(fēng)正壓恒溫恒濕檢驗(yàn)豬舍隔離飼養(yǎng)，25日齡時(shí)隨機(jī)分為2組，分別為：試驗(yàn)組和對(duì)照組，隔離飼養(yǎng)，每組各6頭豬。

1.3 TF制備 按照本課題組已獲授權(quán)的國(guó)家發(fā)明專利制備TF[11-13]：以健康豬脾臟為原料，經(jīng)勻漿、細(xì)胞破碎、滅活、微濾、超濾后精制而成。經(jīng)檢驗(yàn)，所制備TF的pH值為7.1，多肽含量為3.2 mg/mL，核糖含量為92.0 μg/mL，脫E受體法效力檢驗(yàn)活力為16%，細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于10 EU/mL，在251 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，OD260nm/OD280nm比值為2.22，蛋白質(zhì)定性檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、熱原檢驗(yàn)、異常毒性檢查、過敏反應(yīng)檢查、安全檢驗(yàn)均合格。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 同窩健康檢驗(yàn)用仔豬25日齡時(shí)，試驗(yàn)組注射TF，對(duì)照組注射生理鹽水，各組注射劑量均為2.0 mL/頭。分別于注射前第3 d及注射后第3 d、7 d、14 d、21 d 采集外周血，阿氏液抗凝，用于檢測(cè)仔豬外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率。所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析和最小顯著性差法（LSD）分析，P＜0.05為差異顯著。

1.5 豬外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率的測(cè)定

1.5.1 試劑配制

1.5.1.1 Hank's液 將0.3%磷酸二氫鉀溶液、0.76%磷酸氫二鈉溶液、2%氯化鉀溶液及20%氯化鈉溶液依次按20 20 20 40比例混合，加葡萄糖1.0 g，溶解混勻，用水稀釋至1 000 mL，并用4%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.3（臨用時(shí)配制）。

1.5.1.2 阿氏液 取氯化鈉0.420 g、枸櫞酸0.055 g、枸櫞酸鈉0.766 g、葡萄糖 2.05 g，加水溶解并稀釋至100 mL，滅菌。

1.5.1.3 分離液 為淋巴細(xì)胞分離液。

1.5.1.4 羊血 取綿羊靜脈血5.0 mL，加入5.0 mL阿氏液中，冰箱保存。

1.5.1.5 固定液 取25%戊二醛溶液、3.5%碳酸氫鈉溶液及Hank's液依次按1 1 38比例混合。

1.5.1.6 姬姆薩染色液原液 取姬姆薩染料0.5 g，加甘油33 mL，55～60℃加熱至姬姆薩染料溶解，冷至室溫，加入33 mL甲醇，室溫放置24 h后用濾紙過濾，濾液即為原液。密封室溫保存。

1.5.1.7 染色液 取姬姆薩染色液原液2.0 mL，加Hank's液6.0 mL，搖勻，以1 500 r/min離心10 min，取上清液待用。

1.5.1.8 0.5%臺(tái)盼藍(lán)溶液 1%臺(tái)盼藍(lán)溶液與1.7%NaCl等體積混合，用濾紙過濾。

1.5.2 淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率測(cè)定的操作法

1.5.2.1 豬淋巴細(xì)胞懸液制備 取豬抗凝血，加等量Hank's液稀釋成細(xì)胞懸液后輕輕加入到已含有等量分離液的離心管中。以2 000 r/min離心20 min，小心吸出中間層的淋巴細(xì)胞，放入另一離心管中，加適量Hank's液洗滌，搖勻，以1 500 r/min離心3～5 min，棄去上清，再洗滌一次后用Hank's液適當(dāng)稀釋，用臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(＞95%)，使最終淋巴細(xì)胞濃度為（3×106）～（5×106）個(gè)/mL。

1.5.2.2 綿羊紅血球懸液的制備 取適量羊血，用適量Hank's液洗三次（同前）。棄去上清液，加適量Hank's液稀釋并計(jì)數(shù)，使最終濃度為豬淋巴細(xì)胞懸液濃度的8～10倍。

1.5.2.3 測(cè)定 每支小試管均加入豬淋巴細(xì)胞懸液0.2 mL，再分別加入綿羊紅細(xì)胞懸液0.2 mL，混勻，37℃水浴5 min，500 r/min離心3 min，置4℃冰箱過夜。次日取出，棄去上清液，每管中各加入固定液1滴，輕輕搖勻，靜置10 min，加入染色液2滴并搖勻，靜置15 min后開始計(jì)數(shù)，顯微鏡視野中淡藍(lán)色、較大的細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，共數(shù)計(jì)數(shù)板64個(gè)大方格上所有淋巴細(xì)胞的個(gè)數(shù) (不少于200個(gè))，統(tǒng)計(jì)其中E玫瑰花結(jié)形成的細(xì)胞數(shù) (結(jié)合3個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞)，求得E玫瑰花結(jié)百分率。

2 結(jié) 果

結(jié)果顯示，注射TF后，試驗(yàn)組仔豬外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率明顯提高，于注射TF后第7 d達(dá)到峰值（54.3%）；而對(duì)照組仔豬外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率較穩(wěn)定，維持在31.2%左右，見表1。

試驗(yàn)組仔豬外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率，于注射TF后第3 d、7 d及14 d均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別比對(duì)照組提高了 14.6%、22.0%和 14.9%，見圖 1-圖2。

結(jié)果表明，TF能顯著提高豬外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率。

3 討 論

1949年，Lawrence首次發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌素陽性供體的活淋巴細(xì)胞能使皮試陰性受體轉(zhuǎn)變?yōu)槠ぴ囮栃浴?953-1955年，Lawrence等將結(jié)核菌素陽性供體的白細(xì)胞可透析物質(zhì) （Dialyzable Leukocyte Extract，DLE）重復(fù)試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)DLE具備活淋巴細(xì)胞同樣的功能，即DLE仍具有轉(zhuǎn)移遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用，并把能引起這種效應(yīng)的物質(zhì)稱為 “轉(zhuǎn)移因子”[1-3]。

表1 E玫瑰花結(jié)百分率結(jié)果

圖1 對(duì)照組E玫瑰花結(jié)形成圖例

圖2 試驗(yàn)組E玫瑰花結(jié)形成圖例

自20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)TF至今，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)TF的制備方法、理化特性、生物學(xué)特性、免疫特性、熱原性、毒性及安全性進(jìn)行了廣泛、深入的研究，發(fā)現(xiàn)TF具有分子質(zhì)量小、無毒、無抗原性、不引起過敏反應(yīng)，不產(chǎn)生對(duì)抗抗體且可超越種系界限應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，并且在TF治療免疫缺陷、惡性腫瘤、各種感染性疾病等方面進(jìn)行了治療試驗(yàn)研究，均取得一定的療效。1979年以后，逐漸將TF應(yīng)用于獸醫(yī)免疫和臨床治療，在動(dòng)物疾病防控中發(fā)揮了一定作用[7-17]。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體最主要的免疫活性細(xì)胞，其中T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫。淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，可作為機(jī)體免疫功能的測(cè)試指標(biāo)之一[18-19]。TF可非特異性地增強(qiáng)細(xì)胞免疫，進(jìn)而提高機(jī)體免疫功能[7-10]。不同工藝方法制備的TF所含組分差異不大，但各組分的含量和制品效力會(huì)有較大差異[11-17]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者在制備豬脾犬瘟熱五聯(lián)疫苗特異性TF時(shí)，發(fā)現(xiàn)特異性TF在小鼠E玫瑰花環(huán)形成率及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性方面具有顯著的增強(qiáng)效果[20]。在本試驗(yàn)中，按本發(fā)明專利所制備的TF對(duì)豬淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率的影響結(jié)果顯示，試驗(yàn)組仔豬外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率，于注射TF后第3 d、7 d及14 d均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），分別比對(duì)照組提高了14.6%、22.0%和14.9%。結(jié)果表明，本發(fā)明專利所制備的TF具有顯著提高豬免疫功能的作用。

試驗(yàn)按本課題組已獲授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利制備TF[11-13]，通過肌肉注射研究TF對(duì)豬淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率的影響，結(jié)果顯示TF可顯著提高豬外周血淋巴細(xì)胞E玫瑰花結(jié)百分率和豬免疫功能。