番鴨呼腸孤病毒感染對MPV-GPV弱毒疫苗抗體應答的影響

林鋒強 朱小麗 陳仕龍 肖世峰 程曉霞 王 劭 陳少鶯

（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心 福州 350013）

番鴨呼腸孤病毒病臨床上以軟腳為主要癥狀，以肝、脾表面有多量白點、腎臟腫大、出血、表面有黃色條斑為主要病理變化的傳染病[1-2]。該病在意大利、美國、德國和以色列等國家傳播，國內(nèi)福建、廣東和浙江等省份自1997年以來都有該病發(fā)生的報道，通過血清學調(diào)查表明在番鴨群中廣泛存在呼腸孤病毒感染，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)帶了巨大的經(jīng)濟損失[3-5]。

番鴨呼腸孤病毒為免疫抑制性病毒，能夠感染番鴨、半番鴨和鵝等水禽[6]，感染后引起水禽免疫器官壞死或萎縮等病變，對免疫功能有抑制作用。番鴨養(yǎng)殖過程中番鴨細小病毒（MPV）病和番鴨小鵝瘟?。℅PV）是危害最大的傳染性疾病，造成巨大的經(jīng)濟損失[7-8]。我們研制的番鴨MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗是目前預防這兩種疫病的主要手段，免疫保護率可達90%以上[9]。為了探討番鴨呼腸孤病毒感染對MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗免疫造成的影響，本研究從番鴨呼腸孤病毒感染對MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗抗體應答和番鴨B淋巴細胞增殖反應的變化出發(fā)，探討MDRV感染對番鴨體液免疫應答的影響，為有效防治該病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和疫苗 番鴨呼腸孤病毒（MDRV MW9710株）由本室分離、鑒定并保存。MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗由本實驗室制備（批號20170520）。

1.2 試驗動物 1日齡雛番鴨購自莆田廣東溫氏家禽有限公司，雛鴨未免疫任何疫苗。

1.3 主要儀器及試劑 RPMI-1640購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；LPS購自sigma公司，用RPMI-1640配成1 mg/mL，冷凍保存?zhèn)溆?。MTT購自sigma公司，用RPMI-1640配成5 mg/mL，冷凍保存?zhèn)溆?。淋巴細胞分離液購自上海恒信化學試劑有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海化學試劑研究所；ELX800UV酶標儀為Bio-tek產(chǎn)品。

1.4 試驗分組及設計 100羽番鴨分為對照組（50羽）、MDRV(1 200，50羽）。1日齡時對照組注射0.2 mL Hank's；MDRV組感染量按1 200稀釋病毒原液后腿肌注射0.2 mL/羽（103.8TCID50/羽）。攻毒后隔離飼養(yǎng)。

1.5 病毒感染對MPV-GPV弱毒疫苗誘發(fā)抗體反應的影響 取對照組和MDRV組各10羽，于1日齡時腿肌免疫MPV-GPV弱毒疫苗1羽份/羽，于免疫后 7 d、14 d、21 d、28 d 采血分離血清，用 LPAI法檢測抗MPV和GPV抗體，比較試驗組與對照組之間的差異。

1.6 淋巴細胞分離

1.6.1 番鴨外周血淋巴細胞分離 感染后第7 d、14 d、21 d和28 d將無菌心臟采集番鴨抗凝全血疊加于等量的淋巴細胞分離液上；3 000 r/min離心10 min，吸取淋巴細胞層，移入無菌離心管中；加入適量Hank's液，離心10 min，棄上清，重復洗滌3次；加入2 mL淋巴細胞培養(yǎng)液懸浮細胞；6 g/L臺酚藍染色計數(shù)，用淋巴細胞培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL。

1.6.2 脾臟和法氏囊淋巴細胞分離 感染后第7 d、14 d、21 d和28 d將無菌采集的脾臟和法氏囊分別放入已盛有Hank's液的平皿中，用滅菌剪刀、鑷子剝?nèi)ケ荒?；剪碎后，移入滅?0 mL離心管中；加入4 mL胰酶，輕輕晃動離心管，使組織和胰酶充分混勻，37℃水浴作用30 min，每隔10 min搖勻一次；消化完畢之后，過平皿中的200目篩網(wǎng)，分別收集組織細胞懸液，3 000 r/min，離心10 min；棄上清，加入紅細胞裂解液3 mL，重懸沉淀細胞，冰浴作用30 min，待紅細胞完全破碎后，3 000 r/min離心10 min，棄上清；Hank's液洗3次，加入2 mL淋巴細胞培養(yǎng)液重懸細胞，臺酚藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為 5×106個/mL。

1.7 淋巴細胞增殖反應 試驗孔每孔加50 μL細胞懸液和 50 μL 20 μg/mL ConA， 對照孔加 50 μL細胞懸液和50 μL RMPI 1640完全培養(yǎng)基，均設3個重復，并設RMPI 1640空白孔。40℃、5%CO2培養(yǎng)60 h。培養(yǎng)結束前3 h，各孔加入10 μL MTT。培養(yǎng)結束后2 000 r/min離心10 min，傾去上清液，加入150 μL DMSO溶液反應20 min，酶標儀檢測各孔OD570nm值。用刺激指數(shù)（SI）評價組間差異性。SI計算方法：

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 使用Microsoft Excel軟件進行標準差和方差分析，不同組別的所有數(shù)據(jù)用t檢驗確定差異顯著性。

2 結 果

2.1 MDRV感染對番鴨GPV抗體應答的影響由圖1可以看出：1日齡番鴨免疫MPV-GPV二聯(lián)疫苗后，IM 7 d時所有番鴨GPV-LPAI效價均為陽性，達3log2以上。隨后持續(xù)上升，到IM 21 d后效價可達6log2以上，可持續(xù)到IM 28 d。 而1日齡番鴨感染MDRV后免疫MPV-GPV二聯(lián)疫苗，IM 7 d時番鴨GPV-LPAI效價平均值1.5log2；隨后緩慢上升，到IM 21-28 d時GPV-LPAI效價平均值維持在約3log2。與單獨免疫組相比，GPV-LPAI效價大大降低，不能提供有效保護。說明MDRV感染嚴重干擾了番鴨小鵝瘟疫苗的抗體免疫應答，使番鴨對番鴨小鵝瘟病毒的易感性增強。

圖1 MDRV感染對番鴨GPV抗體免疫應答的影響

2.2 MDRV感染對番鴨MPV抗體應答的影響由圖2可以看出：1日齡番鴨免疫MPV-GPV二聯(lián)疫苗后，IM 7 d時所有番鴨GPV-LPAI效價均為陽性，達3log2以上。隨后持續(xù)上升，到IM 21 d后效價可達6log2以上，可持續(xù)到IM 28 d。而1日齡番鴨感染MDRV后免疫MPV-GPV二聯(lián)疫苗，IM 7 d時番鴨GPV-LPAI效價平均值1.5log2；隨后緩慢上升，到IM 21-28 d時GPV-LPAI效價平均值維持在約3log2。與單獨免疫組相比，GPV-LPAI效價大大降低，不能提供有效保護。說明MDRV感染嚴重干擾了番鴨MPV的抗體免疫應答，使番鴨對番鴨MPV的易感性增強。

圖2 MDRV感染對番鴨MPV抗體應答的影響

2.3 番鴨外周血液B淋巴細胞增殖功能的變化1日齡番鴨人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴細胞增殖指數(shù)與對照組相比，差異顯著（P<0.05）。PI 14-28 d與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。表明MDRV感染抑制了外周血B淋巴細胞增殖功能。

表1 番鴨外周血B淋巴細胞增殖功能的變化（x±s，n=5）

2.4 番鴨法氏囊B淋巴細胞增殖功能的變化1日齡番鴨人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴細胞增殖指數(shù)與對照組相比，差異顯著（P<0.05）。PI 14-28 d與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。表明MDRV感染抑制了法氏囊B淋巴細胞增殖功能。

表2 番鴨胸腺B細胞增殖功能的變化（x±s，n=5）

2.5 番鴨脾臟B淋巴細胞增殖功能的變化 1日齡番鴨人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴細胞增殖指數(shù)與對照組相比，差異顯著（P<0.05）。PI 14-28 d與對照組相比差異極顯著 （P<0.01）。表明MDRV感染抑制了脾臟B淋巴細胞增殖功能。

表3 番鴨脾臟B淋巴細胞增殖功能的變化（x±s，n=5）

3 討 論

體液免疫應答由B細胞介導，B細胞分化過程可分為2個階段，即抗原非依賴期和抗原依賴期。在抗原非依賴期，B細胞分化與抗原刺激無關，主要在中樞免疫器官內(nèi)進行，法氏囊是禽類體液免疫中樞器官，是產(chǎn)生成熟B淋巴細胞的基礎；而抗原依賴期是指成熟B細胞受抗原刺激后，繼續(xù)分化為合成和分泌抗體的漿細胞階段，這個階段主要在外周免疫器官內(nèi)進行包括了對抗原的識別、活化、增殖等過程[10]。法氏囊和脾臟損傷、B淋巴細胞數(shù)量減少及其增殖功能降低，嚴重影響了機體的體液免疫應答和免疫機能[11-12]。

近年來流行病學調(diào)查表明MDRV在我國番鴨飼養(yǎng)過程中普遍存在，番鴨常發(fā)生其他細菌或病毒的繼發(fā)感染或并發(fā)感染，產(chǎn)生的原因是番鴨呼腸孤病毒導致番鴨免疫功能下降[13-14]。王全溪等研究發(fā)現(xiàn)，MDRV感染脾漿細胞數(shù)量、淋巴細胞在感染過程中明顯減少，導致機體的細胞免疫和體液免疫受到嚴重破壞[15]。陳志勝等研究表明雛番鴨呼腸孤病毒對雛鴨免疫器官的細胞凋亡具有誘導作用。揭示該病毒致病機理與淋巴細胞凋亡從而引起的免疫抑制相關[16]。盧玉葵等檢測免疫組織TANAE+、漿細胞，細胞數(shù)量的變化發(fā)現(xiàn)感染MDRV后番鴨免疫器官T細胞、漿細胞明顯減少[17]。

本研究認為番鴨呼腸孤病毒感染嚴重干擾了番鴨MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗的抗體應答，使番鴨在易感日齡抗體效價大大降低，處于易感狀態(tài)。MDRV感染導致MDGPV活疫苗免疫抗體效價不合格 （判定標準為14日齡免疫番鴨MDGPV LPAI抗體效價大于3log2），造成免疫失敗?？赡艿脑蚴怯捎贛DRV感染抑制IL-2和IFN-γ等細胞因子生成，使B細胞增殖和分泌抗體能力減弱，抗體免疫應答水平下降，導致番鴨對MDGPV感染更加易感，危害性大大加強。MDRV感染后外周血B淋巴細胞增殖能力下降，抑制IL-2和IFN-γ生成。從細胞因子免疫調(diào)節(jié)功能來看，IL-2能夠促進B細胞增殖和分泌抗體，IFN-γ能夠促進B細胞增殖分化。這兩種細胞因子抑制生成與導致體液免疫應答水平顯著下降有一定的相關性。

因此，建議臨床上要重視對番鴨呼腸孤病毒病的免疫，降低因MDRV免疫抑制導致的其他病毒感染（如番鴨三周病或小鵝瘟等）的危害性增強，減少經(jīng)濟損失。