川西藏區(qū)牦牛酸醡肉中產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶菌株的分離鑒定及其生理特性分析

何江紅，王榮鈺，2，舒小芳，趙潔，盧雪松*

(1.四川旅游學(xué)院，成都 610100；2.四川理工學(xué)院，四川 自貢 643000)

酸肉是我國西南少數(shù)民族地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵肉制品，以豬肉、魚肉為原料，輔以玉米粉、米粉或青稞粉及多種調(diào)味料在自然條件下經(jīng)厭氧發(fā)酵而成，品種主要分為三大類：湖南湘西地區(qū)侗族傳統(tǒng)酸肉、貴州荔波傳統(tǒng)酸肉、川西藏區(qū)臭肉[1-3]。國內(nèi)外有關(guān)酸肉的報(bào)道主要針對發(fā)酵肉的生產(chǎn)工藝、發(fā)酵條件、發(fā)酵風(fēng)味形成及風(fēng)味變化[4-6]。李華麗等人研究了鹽濃度、葡萄糖濃度、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對酸肉pH值的影響，確定了酸肉在自然發(fā)酵下的最佳發(fā)酵條件，說明了發(fā)酵肉制品的優(yōu)越性[7，8]。竺尚武等人對金華火腿中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究，得出經(jīng)過長期的腌制和成熟過程,肌肉蛋白和脂肪在蛋白酶和脂肪酶的作用下,產(chǎn)生大量更易于消化吸收的多肽、游離氨基酸、游離脂肪酸等物質(zhì),并形成大量的揮發(fā)性化合物,賦予腌制肉品獨(dú)特的香氣[9-11]。

傳統(tǒng)酸肉是采用多菌種混合自然發(fā)酵，菌種主要來源于原材料以及自然環(huán)境。由于自然狀態(tài)下，微生物的種類與生理特性因環(huán)境條件的影響極大，因此傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)難以控制酸肉的食用品質(zhì)與安全問題，阻礙了酸肉的工業(yè)化、規(guī)模化生產(chǎn)。目前已有學(xué)者對酸肉制品的優(yōu)勢菌種進(jìn)行篩選及鑒定[12-16]，李宗軍等人還發(fā)現(xiàn)酸醡肉的優(yōu)勢菌群主要為乳酸菌、微球菌及酵母菌。周才瓊等對渝黔苗漢雜居地區(qū)傳統(tǒng)酸肉有關(guān)微生物區(qū)系和營養(yǎng)特性進(jìn)行了研究，研究表明發(fā)酵可以提高酸肉蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值。陳曦、周彤等人從貴州酸肉中篩選出具有高亞硝酸鹽降解和耐受能力的乳酸菌。杜斌、李苗苗等人從貴州傳統(tǒng)酸肉、腌魚中篩選鑒定出可降解膽固醇的乳酸菌，為傳統(tǒng)酸肉制品的保健功能作用提供了研究基礎(chǔ)。眾多研究表明，微生物的種類與特性是酸肉發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素之一，其為酸肉提供了良好的風(fēng)味，改變了肉質(zhì)的組織性狀，有效抑制了有害物質(zhì)產(chǎn)生，且縮短了發(fā)酵周期。

牦牛是高寒地區(qū)的特有牛種，屬于草食性反芻家畜，半野生放牧的飼養(yǎng)方式，牦牛肉富含蛋白質(zhì)和氨基酸以及胡蘿卜素、磷、鈣等微量元素，但因其飼養(yǎng)周期長，肉膻味重，肉質(zhì)粗老，口感堅(jiān)韌，硬度較大，對產(chǎn)品加工產(chǎn)生了極大的阻礙與限制[17，18]。從川西藏區(qū)扎壩臭豬肉加工中獲取靈感，并借鑒川渝地區(qū)傳統(tǒng)酸醡肉的發(fā)酵工藝，研發(fā)了牦牛酸醡肉，并研究了該產(chǎn)品在不同烹飪方式下的食用品質(zhì)[19]。現(xiàn)階段牦牛酸醡肉加工技術(shù)尚屬于自然發(fā)酵。在牦牛酸醡肉發(fā)酵過程中，微生物所產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶作用于牦牛肉和青稞粉，改善牦牛肉粗老的肉質(zhì)，同時(shí)又能賦予產(chǎn)品以特殊風(fēng)味[20，21]。但對于川西藏區(qū)牦牛酸醡肉自然發(fā)酵過程中微生物特性研究的相關(guān)報(bào)道尚屬空白。本實(shí)驗(yàn)從牦牛酸醡肉中分離產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶的菌株，對其進(jìn)行產(chǎn)酶活性和生理特性研究，經(jīng)基因測序，確定目標(biāo)菌。后期可將目標(biāo)菌應(yīng)用到牦牛酸醡肉發(fā)酵劑研發(fā)中。以期為后續(xù)牦牛酸醡肉實(shí)現(xiàn)工業(yè)化、規(guī)?；?、規(guī)范化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牦牛肉：符合GB 18393—2001《牛羊屠宰產(chǎn)品品質(zhì)檢驗(yàn)規(guī)程》，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天購自四川省甘孜州白玉縣綜合農(nóng)貿(mào)市場。實(shí)驗(yàn)室自制40目炒青稞全粉，由甘孜州農(nóng)科所八美農(nóng)場提供的康青8號(2016，2017年產(chǎn))。小西瓜白砂糖：北京廚大媽食品集團(tuán)有限公司；綠色生態(tài)鹽：四川久大制鹽有限公司；窩窩醪糟：成都巨龍生物科技有限公司；干辣椒、辣椒粉、花椒粉、生姜、大蔥、蒜、八角粉：購于成都市龍泉驛區(qū)平安菜市。

培養(yǎng)基配方藥品 北京奧博星生物科技有限公司；可溶性淀粉 成都市科隆化工試劑廠；蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸石碳酸棉藍(lán)染液、酪蛋白、酪氨酸、結(jié)晶紫 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫、95%乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP0201147047型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；QYC-2102C型搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9140型電熱恒溫干燥箱 上海三發(fā)科技儀器有限公司；YX-280立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；BH200微生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；722S型分光光度計(jì) 無錫天牧儀器科技有限公司；HHS-8S型恒溫水浴鍋 上海光地儀器有限公司。

1.3 方法[22-28]

1.3.1 樣品制備

根據(jù)國家發(fā)明專利201610348936.2所提供的加工方法進(jìn)行制作：(1)將曬干后干凈的青稞翻炒并進(jìn)行打粉，獲得炒青稞粉；(2)將牦牛肉洗凈剔除筋腱，切塊備用；(3)按比例將炒青稞粉、辣椒粉、花椒粉、香辛料、酒釀、姜末、白糖和食鹽混合，均勻涂抹在牦牛肉上，于密閉容器中發(fā)酵。

1.3.2 菌株分離

參照GB 4789.2—2016提供的方法對發(fā)酵過程中的牦牛酸醡肉進(jìn)行取樣制樣，利用選擇培養(yǎng)基篩選出芽孢桿菌、乳酸菌、真菌。

1.3.3 產(chǎn)酶菌株篩選

1.3.3.1 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選

將分離純化后的菌株接種到對應(yīng)產(chǎn)蛋白酶篩選培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌株周圍是否有蛋白酶水解圈，若有，即判定該菌株具有產(chǎn)蛋白酶活性。

1.3.3.2 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選

將分離純化后的菌株接種到對應(yīng)淀粉培養(yǎng)基平板上，36 ℃培養(yǎng)48 h后將碘液滴加菌落上，有透明水解圈的菌落即判定該菌有產(chǎn)淀粉酶活力。

1.3.4 產(chǎn)酶活性測定

1.3.4.1 產(chǎn)蛋白酶活力

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》提供的方法測定。

1.3.4.2 產(chǎn)淀粉酶活力

參照提供的淀粉酶活力測定方法測定。

1.3.5 形態(tài)學(xué)鑒定

1.3.5.1 菌落形態(tài)觀察

按無菌操作將各個(gè)菌株接種于對應(yīng)的固體培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度等，做好記錄。

1.3.5.2 個(gè)體形態(tài)觀察

按微生物指導(dǎo)書中革蘭氏染色法對各菌株染色，辨別其為陽性菌或是陰性菌[29]，并在100倍油鏡下觀察其菌體形態(tài)、大小、有無芽孢及其著生位置等，毛霉菌采用乳酸石碳酸棉藍(lán)染色。嚴(yán)謹(jǐn)觀察、描述、拍照、記錄。

1.3.6 生理特性研究

產(chǎn)過氧化氫酶活性；糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；乳酸菌產(chǎn)酸能力測定。

1.3.7 菌株基因序列測定

以活化后的目的菌株菌落為模板，細(xì)菌按照DP302試劑盒提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rDNA片段，引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物，引物序列如下：

27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

真菌按照DP336試劑盒提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增ITS片段，引物為真菌ITS通用引物，引物序列如下：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR體系為25 μL：27F和1492R各1 μL，PremixTaq酶12.5 μL，DNA模板適量，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系25 μL。

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 8 min，變性95 ℃ 45 s，復(fù)性55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)，補(bǔ)充延伸72 ℃ 10 min，保存于12 ℃ 5～10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測后,送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，將所測定菌株的序列同GenBank中已提交的序列進(jìn)行B1astN分析和同源比對，確定菌株種屬，再利用MEGA 5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

選擇培養(yǎng)基，從牦牛酸醡肉中共分離純化得到乳酸菌11株、芽孢桿菌10株、真菌17株(不排除同種菌)，一一編號，保存于4 ℃冰箱備用。

2.2 產(chǎn)酶菌株的篩選

經(jīng)產(chǎn)蛋白酶活性篩選，共有7株菌有產(chǎn)蛋白酶能力，其中有2株乳酸菌，2株真菌，3株芽孢桿菌，分別編號為R1，R2，Z1，Z2，Y1，Y2，Y3；經(jīng)產(chǎn)淀粉酶活性篩選，共有3株菌有產(chǎn)淀粉酶能力，且均為具有產(chǎn)蛋白酶能力的芽孢桿菌，即為Y1，Y2，Y3，詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 產(chǎn)蛋白酶能力Table 1 Protease producing ability

2.3 產(chǎn)酶活性分析

2.3.1 產(chǎn)蛋白酶活性

表2 菌株產(chǎn)蛋白酶活力Table 2 The protease-producing abilities of the strains

注：數(shù)據(jù)中標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖1 各菌株產(chǎn)蛋白酶活力對比Fig.1 Comparison of protease production capacity of each strain

由表2和圖1可知，各種菌產(chǎn)蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)，其中芽孢桿菌Y1，Y2，Y3產(chǎn)蛋白酶活力最佳，其次是乳酸菌R1和R2，Z1產(chǎn)蛋白酶活力最差。

2.3.2 產(chǎn)淀粉酶活性

三株芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活力差異顯著(P<0.05)，其中Y1最強(qiáng)，其次是Y2，Y3產(chǎn)酶活力較弱，見表3和圖2。

表3 菌株產(chǎn)淀粉酶活性Table 3 The ability of the strain to produce amylase

注：數(shù)據(jù)中標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 各菌株產(chǎn)淀粉酶活力對比Fig.2 Comparison of amylase production capacity of each strain

2.4 形態(tài)學(xué)鑒定

對分離出的7株產(chǎn)蛋白酶菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察鑒定。通過革蘭氏染色和霉菌的乳酸石碳酸棉藍(lán)染色，觀察菌株的個(gè)體形態(tài)，并確定有6株菌為革蘭氏陽性菌，觀察結(jié)果見表4。

表4 形態(tài)描述Table 4 Morphological description

2.5 生理特性分析

生理生化特征分析結(jié)果見表5，參照伯杰細(xì)菌鑒定手冊，菌株R1，R2，Y1，Y2，Y3，Z1，Z2的生理特性和植物乳桿菌、戊糖片球菌、淀粉液化芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌亞種、鐮刀霉、黑曲霉的基本特征相吻合。根據(jù)結(jié)果可知7株菌株都具有良好的分解糖類的能力，其中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖所有菌株均能分解，具有糖酵解能力是發(fā)酵菌所必須需能力。此外，2株乳酸菌也具有良好的分解乳糖的能力，它們不僅能利用來自青稞的糖分，同時(shí)也能利用來自牦牛肉的糖分進(jìn)行發(fā)酵，屬于優(yōu)質(zhì)發(fā)酵菌。

表5 生理特性分析Table 5 Physiological analysis

對2株乳酸菌產(chǎn)酸能力的測定結(jié)果見表6，R1和R2均具有較好的產(chǎn)酸能力，能有效地降低發(fā)酵體系的pH，從而產(chǎn)生酸醡肉特有的酸味，并且其產(chǎn)生的酸性環(huán)境能有效地抑制其他雜菌的侵染，防止發(fā)酵過程發(fā)生腐敗。對比2株乳酸菌的產(chǎn)酸能力可知，R1產(chǎn)酸能力優(yōu)于R2，因此在實(shí)際發(fā)酵劑的配制過程中，可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品的風(fēng)味要求調(diào)整2種菌株的使用配比。

表6 乳酸菌產(chǎn)酸能力Table 6 The acid-producing ability of lactic acid bacteria

2.6 基因序列測定

根據(jù)1.3.7的方法步驟，處理篩選到的2株乳酸菌、3株芽孢桿菌和2株真菌，得到相應(yīng)菌株的16S rDNA序列和ITS序列，將各個(gè)菌株序列在CNBI基因庫中進(jìn)行同源性比較，獲得和各菌株序列相似度最高的菌株，即認(rèn)定該菌株種類，具體結(jié)果見表7，發(fā)育樹見圖3和圖4。

表7 基因測序結(jié)果Table 7 Gene sequencing results

圖3 細(xì)菌發(fā)育樹Fig.3 Bacterial growth tree

圖4 真菌發(fā)育樹Fig.4 Mycogenetic growth tree

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)酵的牦牛酸醡肉中分離出了7株菌(R1，R2，Y1，Y2，Y3，Z1，Z2)，所有菌均具有產(chǎn)蛋白酶活力，其中Y1，Y2，Y3還具有產(chǎn)淀粉酶活力。通過基因測序測定為植物乳桿菌、戊糖片球菌、淀粉液化芽孢桿菌、多粘類枯草芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌亞種、鐮刀霉、黑曲霉。根據(jù)其各自產(chǎn)酶分析，得出其中產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)的是淀粉液化芽孢桿菌(108.7 U/mL)、多粘類枯草芽孢桿菌(102.75 U/mL)、枯草芽孢桿菌亞種(103.89 U/mL)，其中植物乳桿菌(71.81 U/mL)和戊糖片球菌(75.81 U/mL)也具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力；產(chǎn)淀粉酶活性測定結(jié)果指出，其產(chǎn)淀粉酶活力分別為淀粉液化芽孢桿菌(74 U/mL)、多粘類枯草芽孢桿菌(64 U/mL)、枯草芽孢桿菌亞種(40 U/mL)。3株芽孢桿菌同時(shí)具有產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶活性能充分利用作為發(fā)酵粉的青稞中的淀粉進(jìn)行發(fā)酵，屬于優(yōu)質(zhì)發(fā)酵菌。目前，產(chǎn)蛋白酶微生物以芽孢桿菌和霉菌為主，而本實(shí)驗(yàn)篩選出的2株乳酸菌同樣有著較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力，值得進(jìn)一步的研究開發(fā)。