小麥TCP基因家族的全基因組鑒定和對熱脅迫的響應(yīng)

丁 寧，李梓彰，田 文，黨仁美，劉媛媛，聞珊珊

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西楊凌 712100)

TCP蛋白作為植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，分別以玉米中 teosinte branches1(tb1) 、金魚草中cycloidea(cyc)和水稻中PCF三個基因的首字母命名，在植物細胞增殖和生長過程中發(fā)揮著重要作用[1]。許多物種的TCP基因家族已經(jīng)被鑒定[2-5]，它可以參與不同激素的信號通路，介導(dǎo)對赤霉酸、細胞分裂素、脫落酸、茉莉酸、油菜素內(nèi)酯和吲哚-3-乙酸的活性調(diào)控[6]。

TCP蛋白由59個氨基酸組成的堿性螺旋I-環(huán)-螺旋II(bHLH)結(jié)構(gòu)組成，有I類(也稱為PCF或TCP-P類)和II類(也稱為CYC/TB1和CIN或TCP-C)兩個家族。I類亞家族中的PCF1和PCF2蛋白[7]可以同源或異源二聚體的形式與增殖細胞核抗原(PCNA)的水稻啟動子元件特異性結(jié)合，而PCNA是與DNA復(fù)制和細胞周期控制相關(guān)的基因[8]。II類亞家族可進一步細分為CIN和CYC/TB1兩個分支。CIN和CYC/TB1(或ECE)中的基因分別參與外側(cè)器官發(fā)育和腋生分生組織的發(fā)育，從而分別產(chǎn)生花或側(cè)枝[2]。

作為DNA結(jié)合蛋白，一些TCP基因?qū)θ~綠體或核基因的轉(zhuǎn)錄也有調(diào)控作用，它們可以自我激活或與其他基因的順式元件相互作用的方式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[9-10]。此外，植物TCP類轉(zhuǎn)錄因子還參與分枝、配子、葉和花的發(fā)育以及株高、晝夜節(jié)律的調(diào)控等生理活動[11]。黎飛飛等[12]在鄭麥7698中通過電子克隆得到水稻 TCP-1的同源基因 TaTCP-1A，并通過基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法證明該基因在一定程度上可以促進小麥愈傷組織的再生。Yuji Yamasaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不管小麥種子是否處于休眠或者其存在大小、重量方面的差異，TCP可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控種子胚的成熟，進一步預(yù)測得知SITEIIATCYTC被證明在種子發(fā)芽中與蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達上調(diào)有關(guān)。Song等[14]通過對小麥幼穗進行0 ℃處理，鑒定到192個microRNAs，其中TCP和其他轉(zhuǎn)錄因子一起在冷脅迫中靶向特異的miRNA表達而導(dǎo)致異常的生殖器官發(fā)育。

高溫會直接影響小麥的發(fā)育和籽粒品質(zhì)。據(jù)報道，溫度升高2 ℃以上可能導(dǎo)致小麥產(chǎn)量降低50%。為保證小麥在高溫條件下穩(wěn)定高產(chǎn)，開展小麥耐熱基因的鑒定和應(yīng)用研究有很重要的現(xiàn)實意義。小麥基因組數(shù)據(jù)的不斷完善和釋放，使得在全基因組水平對小麥基因進行鑒定和分析成為可能。目前，對小麥TCP基因在全基因組水平的研究尚未見報道，因此，本研究利用生物信息學方法和qRT-PCR技術(shù)在全基因組水平對TaTCP基因的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、進化壓力選擇指標和RAN-seq表達模式等進行研究，并對候選耐熱基因進行熒光定量驗證，以期為小麥TCP基因的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本研究所用材料和方法詳見田文等[15]的“普通小麥DREB基因家族的全基因組鑒定及熱脅迫下的表達模式分析”一文。qRT-PCR分析中所用的特異性引物見表1。

表1 熒光定量PCR的引物Table 1 Primers for qRT-PCR

青色代表這三個亞家族中的保守殘基；紅色代表具有類似電荷或疏水性的氨基酸；棕色代表在CYC/TB1和CIN蛋白中保守的殘基，酒紅色表示只在CYC/TB1蛋白中，淡黃色表示僅在CIN蛋白中，淺紅色表示在PCF蛋白質(zhì)中。對應(yīng)于序列比對結(jié)果下方的字母高度反映了該處氨基酸出現(xiàn)的相對頻率。

Lilac colour boxes represent the conserved residues in these three classes; amino acids with similar charge or hydrophobicity are in red; residues conserved in CYC/TB1 and CIN proteins are shown in brown; residues only conserved in CYC/TB1 proteins are shown in wine red; residues only conserved in CIN proteins are shown in light yellow; residues conserved in PCF proteins are shown in light red. The height of the letter below the sequence alignment result reflects the relative occurrence frequency of the amino acid at that position.

圖1TCP氨基酸序列的比對

Fig.1AlignmentofTCPmotifsinputativeaminoacidsequences

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥中TCP基因家族的候選基因鑒定

本研究最終得到58個非冗余且包含完整結(jié)構(gòu)域的小麥TCP候選基因。通過在線工具計算后統(tǒng)計，58個TaTCP的蛋白質(zhì)序列長度介于177～577 aa，分子量為18.2～61.6 kD，等電點pI介于4.95～11.66之間，開放閱讀框ORF長度為587～1 734 bp，這些都說明小麥TCP基因家族成員之間存在較大的組成差異。然后結(jié)合染色體位置和系統(tǒng)發(fā)育樹將候選基因命名。發(fā)現(xiàn)58個TaTCP基因分布在除6A以外的其余20條染色體上，并且有20個基因位于5號染色體中，占基因總數(shù)的34.48%，說明5號染色體在TaTCP基因的進化中具有重要作用。然而由于小麥基因組的詳細注釋還沒有完成，所以TaTCP基因在染色體中的確切位置還不清楚。

為了驗證本研究對候選TaTCP基因的預(yù)測，根據(jù)Cubas(1999)提出的方法[1]，對蛋白序列中的保守基序進行了進一步研究。結(jié)果顯示(圖1)，在TCP-C亞家族中，bHLH中堿性區(qū)域含有一個雙向核定位信號(NLS)，該信號對于蛋白質(zhì)向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運是必需的，而TCP-P亞家族中的堿性區(qū)域只包含部分NLS，推測這兩個亞家族之間的蛋白質(zhì)序列差異可能導(dǎo)致其功能上的不同。TCP-C和TCP-P亞家族分別在堿性區(qū)域中都含有保守基序KDRHSK(I/V)-TG-RDRRΨ和(K/R)DRH-KV-G-RGRRΨ，其中Ψ代表任何疏水殘基，如甲硫氨酸(M)、異亮氨酸(I)。在兩個亞家族中，連接兩個螺旋的區(qū)域具有相同的保守甘氨酸(G)、天冬氨酸(D)和絲氨酸(S)殘基。

2.2 TaTCP的系統(tǒng)發(fā)育和基因結(jié)構(gòu)分析

為研究小麥TCP基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖2)顯示，所有TCP成員分為TCP-C和TCP-P亞家族，TCP-C亞家族又分為兩個小亞類。此外，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)育樹中有些數(shù)值不是很高，這可能是由于全長蛋白質(zhì)序列的相似性低造成的。相當多的TaTCP成員(89.83%)不含內(nèi)含子。只有6個基因( TaTCP6-D、 TaTCP8-D、 TaTCP17-B、 TaTCP20-A、 TaTCP20-B和 TaTCP22-A)在編碼序列中含有一個內(nèi)含子，可能是基因在進化過程中產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)上的變化。而兩個亞家族之間具有相似的基因結(jié)構(gòu)，表明小麥TCP基因家族在進化上存在一定的保守性，這種結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性可能與TCP參與植物多種重要的生物學過程密切相關(guān)。為了顯示進化關(guān)系，根據(jù)58個TaTCP、24個AtTCP和22個OsTCP的全長蛋白質(zhì)序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。58個TaTCP中有26個在PCF亞家族，20個在CIN亞家族，12個在CYC/TB1亞家族，預(yù)測TaTCP基因家族可能與相同分類的直系同源基因具有相似的生物學功能。

2.3 TaTCP的達爾文壓力選擇分析

達爾文進化選擇的類型通常通過計算Ka/Ks(非同義替換率/同義替換率)之間的比值來衡量，其中Ka/Ks=1用于中性選擇；Ka/Ks<1表示純化選擇；Ka/Ks>1表示正向選擇[16]。烏拉爾圖小麥(T.urartuas)和節(jié)節(jié)麥(A.tauschii)分別作為小麥基因組中A和D基因組的供體物種，大麥也被認為與小麥在起源上存在一定的關(guān)聯(lián)，它們都因為與小麥在進化上關(guān)系密切而被作為直系同源物種。通過序列比對的方法尋找小麥TCP的直系同源基因通過Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫最終確認其功能的相似性。通過命名的22組(每組含有1、2或3個等位基因)TaTCP基因分別在大麥、烏拉爾圖小麥和節(jié)節(jié)麥基因組庫中尋找對應(yīng)的直系同源序列(orthologous)。結(jié)果顯示，分別有19、3和2組TaTCP在A、B、D三個亞基因組中與大麥、烏拉爾圖小麥和節(jié)節(jié)麥中存在直系同源基因(表2)。據(jù)統(tǒng)計，在小麥和大麥(MLOC_開頭的ID號)組成的19組直系同源基因?qū)χ?，Ka/Ks的比值范圍為0.0613～0.9474，說明小麥基因相對于大麥進行了純化選擇。在小麥和節(jié)節(jié)麥(F775_開頭的ID號)組成的2組基因?qū)Φ腒a/Ks比值范圍為0～0.3221，說明小麥基因相對于節(jié)節(jié)麥也進行了純化選擇。同樣，小麥與烏拉爾圖小麥(TRIUR3_開頭的ID號)之間所組成的3組直系同源基因?qū)Φ腒a/Ks值介于0.1660～1.2225之間，說明它們之間存在不同的選擇壓力，特別是 TaTCP16-A和 TRIUR3_19119的Ka/Ks比值為1.2225，反映了 TaTCP16-A在進化過程中的正向選擇，這對小麥物種的進化是非常有利的。從尋找的直系同源基因個數(shù)看，烏拉爾圖小麥或節(jié)節(jié)麥的數(shù)量小于大麥，這可能是因為兩個物種(AA和DD)的基因組小于大麥基因組造成的。

2.4 TaTCP基因在小麥不同組織和不同逆境脅迫下的表達分析

用小麥(品種為中國春)5種組織或器官(穗、芽、根、葉和籽粒)和非生物脅迫反應(yīng)(熱和干旱)的RNA-seq數(shù)據(jù)來探究TCP基因在小麥生長和發(fā)育中的潛在生物學功能，發(fā)現(xiàn)大部分同源基因?qū)Ρ憩F(xiàn)出類似的表達模式。圖4所示，在58個候選基因中，35個TaTCP在至少一種組織中檢測到表達?？偣灿?、1、4和3個基因分別在籽粒、莖、根和穗中特異性表達。有些基因缺乏表達數(shù)據(jù)可能涉及特殊的時間和空間表達事件，所以沒有在數(shù)據(jù)庫中檢測到。此外，58個TaTCP基因中沒有一個基因在5種組織中同時檢測到表達值。 TaTCP6-A在葉、根和莖中表達量最高，表明該基因可能參與植物特異性生長調(diào)節(jié)。對獲取的表達數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)， TaTCP5-D作為一個上調(diào)基因，對熱和干旱脅迫的反應(yīng)明顯高于其他TaTCP基因。與對照相比，大部分基因表達值在兩種脅迫條件下沒有太大的變化，這可能是因為TaTCP基因位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的上游位置，與非生物脅迫的應(yīng)答有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。

圖2 TaTCP的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(A)和基因結(jié)構(gòu)(B)Fig.2 Phylogenetic relationships(A) and gene structure(B) of TaTCP

圖3 小麥、水稻和擬南芥TCP的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis TCPs of wheat, rice and Arabidopsis表2 用大麥、烏拉爾圖小麥和節(jié)節(jié)麥作為TaTCP直系同源基因計算的Ka/Ks比率Table 2 Ka/Ks ratio of TaTCP orthologous genes calculated with barley, T.urartuas, and A.tauschii as outgroups

小麥IDWheat gene ID直系同源基因IDOrthologous IDA基因組A-genome Ka/KsB基因組B-genome Ka/KsD基因組D-genome Ka/Ks TaTCP1 MLOC_702660.199 10.190 00.206 3 TaTCP2 MLOC_102140.472 10.490 90.466 6 TaTCP3 MLOC_723930.130 50.212 70.163 1 TaTCP4 MLOC_581420.217 70.238 10.251 6 F775_019230.287 20.322 10.000 0 TaTCP5 MLOC_147850.119 20.167 60.129 5 TaTCP7 MLOC_682850.096 90.104 40.093 9 TaTCP8 MLOC_12004--0.159 7 F775_07590--0.173 9 TaTCP10 MLOC_701160.265 40.290 60.258 5 TRIUR3_317950.471 70.321 50.324 8 TaTCP13 MLOC_46140.230 80.205 10.229 7 TRIUR3_207280.315 80.166 00.206 7 TaTCP14 MLOC_639890.947 40.925 00.945 8 TaTCP16 MLOC_725810.157 40.216 60.132 1 TRIUR3_191191.222 50.740 70.799 7 TaTCP18 MLOC_49381-0.424 20.346 1 TaTCP19 MLOC_23537-0.582 10.598 7 TaTCP22 MLOC_605770.061 30.068 70.066 7

紅色表示基因的表達較強，白色表示中間表達量，藍色表示沒有表達信號。1和2：37 ℃下熱脅迫處理1 h和6 h；3和4：干旱脅迫處理1 h和6 h。

The red color represents the higher expression of relative gene; white indicates intermediate expression value and the blue color indicates no expression signal. 1 and 2:Treatment for 1 h and 6 h under 37 ℃ heat stress,respectively; 3 and 4:Treatment for 1 h and 6 h under drought stress, respectively.

圖4TaTCP基因在五種不同器官或組織中以及在非生物脅迫下的表達譜

Fig.4ExpressionprofilesofTaTCPgenesinfivedifferentorgansortissuesandunderabioticstresses

基于基因表達熱圖，選擇 TaTCP5-A、 TaTCP5-B和 TaTCP5-D三個基因作為研究對象，使用qRT-PCR技術(shù)在35 ℃和42 ℃條件下進一步驗證熱圖的結(jié)果。結(jié)果顯示，在小麥不同的生長發(fā)育時期內(nèi)，三個部分同源基因在不同溫度下的響應(yīng)是不同的。從圖5中看出， TaTCP5-A在12個不同時期和兩種熱脅迫處理下的表達量基本都是下調(diào)的，這與熱圖中的結(jié)果一致；但在分蘗期35 ℃的熱脅迫下和在開花期42 ℃的熱脅迫處理下，該基因都有明顯的的上調(diào)，可能在兩個不同時期， TaTCP5-A在抵御熱脅迫中發(fā)揮作用。 TaTCP5-B在灌漿早期35 ℃的脅迫下表達量上升，說明在灌漿早期該基因是發(fā)揮主要的耐熱功能的因子；而其表達量在42 ℃脅迫下是下降的，說明即使處于同一生育時期，在不同的溫度下基因的表達量都是不同的。而在熱圖中表現(xiàn)明顯的 TaTCP5-D，在分蘗-起身期、拔節(jié)期、拔節(jié)后期、孕穗前期和抽穗期，在35 ℃的處理下表現(xiàn)尤為明顯，特別是在抽穗期間比對照表現(xiàn)出更高的表達水平，表明在這些發(fā)育時期， TaTCP5-D是發(fā)揮耐熱功能的主要因子。通過上述分析，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)在趨勢上基本一致，也證明了使用RNA-seq數(shù)據(jù)評估小麥在不同處理下的轉(zhuǎn)錄表達水平是合理且可行的(圖5)。

A：出苗3天；b：出苗7天；c：分蘗期；d：分蘗-起身期；e：拔節(jié)期；f：拔節(jié)后期；g：孕穗前期；h：抽穗期；i：開花期；j：灌漿早期；k：灌漿期；l：灌漿后期。

A：3 days after germination; b:7 days after germination; c:Tillering; d:Erecting; e:Early jointing; f:Late jointing; g:Early booting; h:Heading stage; i:Flowering; j:Early stage of grain filling; k:Filling; l:Late grain filling stage.

圖5TaTCP5-A/B/D基因在小麥不同發(fā)育時期熱脅迫下的表達水平

Fig.5ExpressionlevelsofTaTCP5-A/B/Datdifferentgrowthstagesunderheatstress

3 討 論

根據(jù)PlantTFDB數(shù)據(jù)庫得知，T.urartu和Aegilopstauschii分別只有4個和5個鑒定到的TCP基因，而本研究中小麥被鑒定到58個非冗余的候選基因。這58個候選基因組可以劃分成22組，除 TaTCP8-D和 TaTCP21-D外，其余20組均含有兩個或三個等位基因。由于它的供體物種都只有少量的TCP基因，所以推斷現(xiàn)在小麥中的TCP基因是隨著其進化經(jīng)歷了基因組的雜交和融合才形成的。有趣的是，其中 TaTCP11-A1和 TaTCP11-A2這兩個基因位于A基因組的同一條染色體上，除了區(qū)段不同外，序列和基因結(jié)構(gòu)完全相同，這種基因組中的串聯(lián)復(fù)制(segmental duplication，SD)導(dǎo)致數(shù)量上的擴增也間接證明了TCP基因在進化過程中的擴展。除了基因組復(fù)制中涉及的SD現(xiàn)象，還有區(qū)段復(fù)制(tandem duplication，TD)、染色體片段的交換、基因的加倍等情況也會導(dǎo)致基因組的持續(xù)擴張，而這些必然會促進表型和功能上的多樣化。除此之外，根據(jù)本文對達爾文進化壓力選擇的分析可知，與小麥構(gòu)成直系同源基因?qū)Φ拇篼溁驍?shù)量比T.urartu和Aegilopstauschii這兩個二倍體供體物種中的基因要多。除了已知大麥的基因組比它們的大之外，還可能因為小麥在經(jīng)歷全基因組復(fù)制(WGD)事件后導(dǎo)致TCP基因的數(shù)量增加，而兩個二倍體物種的基因組變化不大。

相似的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)示著其功能可能具有相似性，通過與其他相近物種的序列分析可以預(yù)測小麥TCP基因的功能。比如：miR319通過與ClassⅡ類TCP中的CIN亞類基因結(jié)合，以轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控的方式調(diào)控基因的表達，在擬南芥和水稻中的TCP基因中均有該小RNA的靶向序列[17]。將位于同一CIN家族的TaTCP分析后發(fā)現(xiàn)， TaTCP16-A、 TaTCP16-B和 TaTCP16-D具有小麥tae-miR319的結(jié)合位點，而這三個部分同源基因是否存在功能上的冗余還有待進一步驗證。不過從進化壓力指標計算中發(fā)現(xiàn)， TaTCP16-A是經(jīng)過正向選擇的結(jié)果，說明這一基因在進化中起著積極的作用；或從熱圖中也可以看出， TaTCP16-A在非生物脅迫中的表達量變化比較顯著，這些證據(jù)都間接證明該基因可以在以后研究的過程中優(yōu)先考慮。

對于TCP基因參與非生物脅迫下的調(diào)控將是研究的熱點之一。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR319可以負向調(diào)控水稻中 OsPCF6和 OsTCP21的表達來增加植株對低溫的防御。Mukhopadhyay等[19]發(fā)現(xiàn)，過表達 OsTCP19可以通過調(diào)控多種激素途徑提高水稻的耐鹽和耐旱性。本研究發(fā)現(xiàn)，TCP的三個部分同源基因在小麥不同生育時期的表達量是不同的，每個基因都在特定生育時期中對耐熱脅迫發(fā)揮主要作用，暗示 TaTCP5基因在抵御熱脅迫中具有不同的生物學功能。結(jié)合環(huán)形進化樹得知， OsTCP19和 TaTCP5都位于CIN亞家族，推測 TaTCP5基因可以通過與不同的激素信號途徑如ABA、JA通路中的關(guān)鍵基因結(jié)合從而提高熱響應(yīng)，而由于該基因沒有預(yù)測到有miRNA的直接靶標，所以是否有轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控難以闡明。 TaTCP5在同一生育時期，35 ℃的脅迫下要比42 ℃下的表達量高，可能是該基因?qū)崦{迫有一定的防御限度，或者在42 ℃脅迫下， TaTCP5不是主要參與熱響應(yīng)的基因。而TCP基因通過對耐熱的響應(yīng)是否可以提高其他脅迫下的交叉適應(yīng)性，或者TCP不同亞家族基因之間是否對耐熱性存在交叉調(diào)控的機制，這些都需要進一步驗證。