傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)4種志賀氏菌快速分型的研究?

李兆杰， 張玉春， 劉玉敏， 江艷華， 王秀杰， 顧華珍， 李正義， 楊麗君

(1.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 威海 264205；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所， 山東 青島 266071；3.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266002)

傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)4種志賀氏菌快速分型的研究?

李兆杰1， 張玉春1， 劉玉敏1， 江艷華2， 王秀杰1， 顧華珍1， 李正義3， 楊麗君1

(1.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 威海 264205；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所， 山東 青島 266071；3.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266002)

應(yīng)用傅立葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)技術(shù)，采集志賀氏菌屬痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae,S.dysenteriae)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri,S.flexneri)、鮑氏志賀氏菌(Shigellaboydii,S.boydii)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigellasonnei,S.sonnei) 4種志賀氏菌的4 000～600 cm-1波數(shù)范圍的中紅外光譜，對(duì)光譜進(jìn)行基線校正、矢量歸一化等處理；應(yīng)用主成分分析(Principal component analysis, PCA)和分級(jí)聚類分析(Hierarchical cluster analysis, HCA)分別對(duì)4種志賀氏菌1 800～900 cm-1波數(shù)范圍的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，通過(guò)對(duì)污染豬肉樣品里分離的可疑S.sonnei、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis)和出血性大腸埃希氏菌((Escherichia.ColiO157: H7)進(jìn)行HCA分析來(lái)驗(yàn)證所建立的數(shù)據(jù)庫(kù)和分型方法。結(jié)果顯示：成功建立了4種志賀氏菌的紅外光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，可以用于可疑目標(biāo)菌的快速分型；PCA和HCA 2種聚類方法均能將4種志賀氏菌進(jìn)行較好分類，而且應(yīng)用建立的數(shù)據(jù)庫(kù)和HCA聚類方法能準(zhǔn)確對(duì)可疑目標(biāo)菌進(jìn)行快速分型，說(shuō)明FT-IR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)運(yùn)算方法，可以將4種志賀氏菌進(jìn)行快速分型。該研究為志賀氏菌的快速分型提供了一種快速簡(jiǎn)便的方法，適應(yīng)于地方疾控部門(mén)和口岸檢疫部門(mén)開(kāi)展志賀氏菌監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)溯源工作。

傅立葉變換紅外光譜; 志賀氏菌; 分型; 主成分分析; 分級(jí)聚類分析

志賀氏菌屬(Shigella)是一類革蘭氏陰性桿菌，是人類細(xì)菌性痢疾最為常見(jiàn)的致病菌，又稱痢疾桿菌。人主要通過(guò)食用被志賀氏菌污染的食品而感染發(fā)病，以潰瘍、大腸化膿性炎癥以及全身中毒癥狀為主要臨床特征。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球的人類痢疾感染病例有1.647億，其中有1.632億病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，并導(dǎo)致110萬(wàn)人死亡，志賀氏菌病的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)現(xiàn)有的想象[1]。

根據(jù)志賀氏菌表面抗原結(jié)構(gòu)的不同，可以將志賀氏菌屬分為4類，包括痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)、鮑氏志賀氏菌(S.boydii)、福氏志賀氏菌(S.flexneri)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(S.sonnei)4個(gè)菌種。志賀氏菌的菌型分布因地域不同而有所差異，了解菌群分布與不同菌型的變遷，對(duì)于預(yù)防痢疾和制備菌苗具有重大意義。此外，在公共衛(wèi)生領(lǐng)域和院內(nèi)感染評(píng)價(jià)常進(jìn)行特定地域食品致病菌檢測(cè)、醫(yī)院感染、局部流行病學(xué)調(diào)查及臨床診斷，也需要準(zhǔn)確而快速簡(jiǎn)便的分型及檢測(cè)技術(shù)。傳統(tǒng)的分型技術(shù)主要基于病原菌的表型如生理、生化特征等[2]，如血清型分型、耐藥性分型、噬菌體分型等，但存在分辨率低、不可重復(fù)等諸多局限性。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于病原菌基因特征的分子分型方法以其重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)逐步取代傳統(tǒng)表型分型方法，成為病原菌分型的趨勢(shì)。比較成熟的分子分型技術(shù)有脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、多位點(diǎn)序列分析(MLST)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP)、多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、基因芯片、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)、質(zhì)粒圖譜分析等[3]。然而，上述方法操作較繁瑣，程序比較復(fù)雜。針對(duì)4種志賀氏菌的快速分型目前尚未有報(bào)道，還是停留在生化和血清學(xué)鑒定的水平上，因此建立其快速、簡(jiǎn)便的分型方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

微生物菌體在中紅外光譜(4 000～400 cm-1波數(shù)范圍)處有特定吸收且具有很強(qiáng)的指紋特征。微生物干涉后的紅外光譜經(jīng)傅立葉變換處理便可得到傅立葉變換紅外光譜。FT-IR技術(shù)讀取的是微生物菌體的所有組成成分化學(xué)鍵的振動(dòng)情況，提供整個(gè)微生物菌體組成成分的光譜定量信息[4]，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)運(yùn)算方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的分類、鑒定[5-9]。前期，我們應(yīng)用FT-IR技術(shù)對(duì)微生物的分類鑒定進(jìn)行了大量研究，探討了FT-IR技術(shù)用于微生物分類鑒定的影響因素[10]，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、李斯特氏菌等分別進(jìn)行了研究[11-13]，證明FT-IR技術(shù)具有強(qiáng)大的微生物分類鑒定能力，而且分辨率和靈敏度非常高。但是，上述研究?jī)H就FT-IR技術(shù)在不同分類層次上的的分類鑒定能力進(jìn)行了研究，尚未就某個(gè)致病菌領(lǐng)域進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究，因此還不能真正應(yīng)用?；诖?，本文選擇志賀氏菌屬所有4種志賀氏菌，首先讀取4種志賀氏菌的傅里葉變換紅外光譜，構(gòu)建其標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，然后應(yīng)用PCA和HCA兩種聚類方法，嘗試建立4 種志賀氏菌的快速分型方法，這將會(huì)為志賀氏菌的分型與檢測(cè)提供了一種有效的工具。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1 菌種S.dysenteriaeCICC 23829、S.flexneriCICC 21678、S.boydiiCICC 21680、S.sonneiCICC 21679、S.enteritidisCICC 21482購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，出血性大腸埃希氏菌O157：H7 ATCC 43895(Escherichia.ColiO157: H7,E.coliO157: H7) 購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。接種菌種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，備用。

1.1.2 試劑 超純水，電阻18.2 mΩ；0.9%生理鹽水；無(wú)水乙醇，分析純級(jí)別；志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素，麥康凱(MAC)瓊脂，木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(XLD)瓊脂，緩沖蛋白胨水(BPW)，四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液，亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液，亞硫酸鉍(BS)瓊脂，改良EC肉湯，改良山梨醇麥康凱(CT-SMAC)瓊脂，營(yíng)養(yǎng)肉湯，購(gòu)自北京陸橋生物科技有限公司，按說(shuō)明書(shū)配置。改良科瑪嘉O157顯色瓊脂購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉公司。

1.2.設(shè)備與材料

ZnSe窗片，直徑25 mm，厚度2 mm，透過(guò)波長(zhǎng)是7 800～440 cm-1，透過(guò)率大于68%；CR22G III離心機(jī)，日本日立公司；核酸蛋白分析儀，Bio-rad公司；(36±1)℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱，3M公司；VERTEX70型傅立葉變換紅外光譜儀，布魯克公司；45 ℃干燥箱，3M公司。

1.3方法

1.3.1 樣品制備 接種4種志賀氏菌S.dysenteriae，S.flexneri，S.boydii和S.sonnei活化肉湯培養(yǎng)物于盛有10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的帶塞大試管中，(36 ±1) ℃ 培養(yǎng)18～24 h，核酸蛋白分析儀測(cè)定菌液濃度。

分別吸取1 mL各菌的肉湯培養(yǎng)物于1.5 mL 離心管中，5 000g離心5 min，棄上清，用1 mL無(wú)菌生理鹽水懸浮洗滌沉淀，再用1 mL 超純水洗滌2次。最后用50 μL 超純水懸浮。準(zhǔn)確吸取10 μL菌懸液于ZnSe 窗片中心位置，涂抹均勻，水平置于45 ℃干燥箱中進(jìn)行烘干。

1.3.2 光譜采集 應(yīng)用傅立葉變換紅外光譜儀對(duì)制備好的樣品進(jìn)行光譜采集，采集模式采用透過(guò)率模式(采用氣氛補(bǔ)償功能去除環(huán)境中的CO2和水蒸氣的吸收光譜干擾)。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：光譜分辨率4 cm-1，波段范圍4 000～600 cm-1[14-15]，64次光譜累計(jì)求平均[16]。

1.3.3 光譜處理及數(shù)據(jù)分析 每個(gè)樣品至少做6次試驗(yàn)，每次做3個(gè)重復(fù)，取平均，取6個(gè)有效數(shù)據(jù)。

光譜預(yù)處理：應(yīng)用OPUS 6.5軟件，對(duì)采集的4種菌的4 000～600 cm-1波數(shù)范圍光譜依次進(jìn)行透過(guò)率-吸光度轉(zhuǎn)化、基線校正(消除基線漂移)，矢量歸一化處理。然后將歸一化后的光譜轉(zhuǎn)化為DPT數(shù)據(jù)點(diǎn)格式，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為Excel數(shù)據(jù)格式，得到4種志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的紅外光譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

選擇各菌1 800～900 cm-1波數(shù)范圍光譜數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入Statistica 6.0和Matlab 6.5軟件，分別進(jìn)行分級(jí)聚類分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)和主成分分析(Principal component analysis，PCA)，得到 4 種志賀氏菌 FT-IR光譜的樹(shù)狀分級(jí)聚類分布圖和主成分聚類分布圖。

1.4方法驗(yàn)證

用活化好的S.sonneiCICC 21679、S.enteritidisCICC 21482和E.coliO157: H7 ATCC 43895菌懸液污染同一份新鮮豬肉樣品。分別根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)》(GB 4789.5-2012)、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》(GB 4789.4-2010)和《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)》(GB/T 4789.36-2008)進(jìn)行檢驗(yàn)，挑取MAC和XLD瓊脂上的可疑志賀氏菌、BS和XLD瓊脂上的可以沙門(mén)氏菌以及CT-SMAC和改良科瑪嘉O157顯色瓊脂上的可疑E.coliO157: H7分別接種營(yíng)養(yǎng)肉湯中，細(xì)菌培養(yǎng)及樣品制備方法同1.3.1。

根據(jù)1.3.2方法采集上述可疑菌的光譜數(shù)據(jù)，并按1.3.3對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，將處理好的數(shù)據(jù)與建立的4種志賀氏菌的標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)合并，利用Statistica 6.0軟件進(jìn)行HCA，得到分級(jí)聚類圖。

2 結(jié)果

2.1平均光譜及光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

4種志賀氏菌的光譜經(jīng)基線校正、適量歸一化預(yù)處理后，對(duì)每種菌的6個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)取平均，得到各種菌的平均光譜(見(jiàn)圖1)。光譜間的一些差異可以用肉眼進(jìn)行觀察區(qū)分，特別是在1 000～1 600 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的光譜差異較明顯，推測(cè)這應(yīng)該是區(qū)分4種志賀氏菌的主要光譜區(qū)域。但是對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確分類需借助計(jì)算機(jī)及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。此外，每個(gè)波數(shù)或每段波數(shù)范圍的光譜與細(xì)菌成分或結(jié)構(gòu)具有特異的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此，細(xì)菌間的差異可以通過(guò)光譜分析直接具體到其生物大分子組成或其結(jié)構(gòu)上[12]。

對(duì)志賀氏菌屬內(nèi)4種菌的FT-IR光譜進(jìn)行一系列預(yù)處理后，得到歸一化后的光譜，即建立了志賀氏菌屬內(nèi)S.dysenteriae，S.flexneri，S.boydii和S.sonnei4種菌的標(biāo)準(zhǔn)的FT-IR光譜數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)提供了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的比對(duì)和參考，利用這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，我們可以對(duì)未知可疑目標(biāo)菌進(jìn)行快速分型。方法為：首先嚴(yán)格按照樣品制備條件和光譜采集條件獲得可疑目標(biāo)菌的光譜，對(duì)光譜按照同樣的方法進(jìn)行預(yù)處理后，與建立的數(shù)據(jù)庫(kù)合并，然后對(duì)合并后的光譜數(shù)據(jù)重新進(jìn)行PCA或HCA聚類分析，根據(jù)可疑目標(biāo)菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中4種Shigella光譜數(shù)據(jù)的聚類情況便可對(duì)可疑菌作出分型的初步判斷。

圖1 4種志賀氏菌的平均光譜圖

2.2數(shù)據(jù)分析

2.2.1 主成分分析(PCA) PCA分析屬于一種非監(jiān)督型統(tǒng)計(jì)方法，通過(guò)線性變換從多個(gè)變量中篩選出幾個(gè)較少的綜合變量，篩選出的這幾個(gè)綜合變量應(yīng)對(duì)于PCA分析具有較大貢獻(xiàn)，且能反應(yīng)原始變量的絕大多數(shù)信息。主成分(Pricipale component, PC)即是通過(guò)線性變換從多個(gè)變量中篩選出的能反應(yīng)原始變量信息、對(duì)PCA分析具有主要貢獻(xiàn)的綜合變量。本研究選取PC1、PC2和PC3等3個(gè)PCs作為聚類依據(jù)，得到主成分聚類三維分布圖(如圖2)。由圖2 可以看出，PCA 分析可以將志賀氏菌屬內(nèi)S.dysenteriae，S.flexneri，S.boydii和S.Sonnei4 種菌進(jìn)行準(zhǔn)確聚類，也說(shuō)

圖2 4種志賀氏菌光譜的PCA聚類分布圖

明4種Shigella光譜之間具有差異性。對(duì)于可疑目標(biāo)菌，將其光譜與構(gòu)建的4種Shigella標(biāo)準(zhǔn)菌株的光譜數(shù)據(jù)庫(kù)合并，對(duì)合并后的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，根據(jù)聚類分布圖中可疑目標(biāo)菌光譜數(shù)據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)菌株光譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的的聚類情況，即可對(duì)可疑目標(biāo)菌的分型情況作出初步判斷。

3 個(gè)主成分PC1、PC2 和PC3 權(quán)重見(jiàn)圖3。由圖3 可知，在1 800～900 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)， 3 個(gè)PCs均具有較大的權(quán)重值，其中PC1權(quán)重值最大，PC2 和PC3 次之，反映出3 個(gè)PCs對(duì)PCA聚類分析的貢獻(xiàn)大小。3 個(gè)PCs對(duì)于聚類的總貢獻(xiàn)率為99.81%(分別為99.3%、0.36%和0.15%)， 說(shuō)明這3 個(gè)PCs能反應(yīng)出原始變量的絕大多數(shù)信息，采用這3 個(gè)PCs建立的PCA聚類分析方法具有可行性。

圖3 4種志賀氏菌光譜的主成分權(quán)重圖

2.2.2 分級(jí)聚類分析(HCA) 對(duì) 4 種Shigella的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA 分析，利用皮爾森積矩相關(guān)系數(shù)(Ward′s method，Pearson r)，用光譜間的距離作為判定依據(jù)，得到樹(shù)狀聚類分布圖，見(jiàn)圖4。結(jié)果證明HCA分析可以將4 種Shigella進(jìn)行成功聚類。同PCA，對(duì)于可疑目標(biāo)菌，將其光譜與構(gòu)建的4種Shigella標(biāo)準(zhǔn)菌株的光譜數(shù)據(jù)庫(kù)合并，對(duì)合并后的數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA分析，通過(guò)觀察樹(shù)狀聚類分布圖中可疑目標(biāo)菌光譜與標(biāo)準(zhǔn)菌株的聚類情況，即可對(duì)可疑目標(biāo)菌的分類鑒定情況進(jìn)行判斷。

2.3方法驗(yàn)證

將污染樣品的可疑菌的光譜數(shù)據(jù)與建立的4種志賀氏菌的標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)合并，將合并數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA聚類分析，得到聚類分布圖，見(jiàn)圖5。由圖5可知，分離的可疑志賀氏菌被聚類到了S.sonnei聚類群中，分離的可疑S.enteritidis和E.coli未被聚類到4種志賀氏菌的任一種聚類群中，而是各自被單獨(dú)聚為一類。而且就光譜間的距離而言，可疑志賀氏菌與S.sonnei聚類群距離最近，而可疑S.enteritidis和E.coli與4種志賀氏菌的聚類群距離都較遠(yuǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明建立的4種志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)和HCA方法可以將志賀氏菌進(jìn)行準(zhǔn)確分型，而且對(duì)于非志賀氏菌也可以對(duì)其準(zhǔn)確排除，避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。

圖4 4種志賀氏菌光譜的HCA聚類分布圖

圖5 方法驗(yàn)證HCA聚類分析結(jié)果

3 討論

本研究首先通過(guò)對(duì)志賀氏菌屬內(nèi)4 種菌的FT-IR 光譜進(jìn)行處理，得到了S.dysenteriae,S.flexneri,S.boydii和S.Sonnei4 種菌的FT-IR 光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，用以未知可疑目標(biāo)菌的快速分型。這對(duì)于志賀氏菌的檢測(cè)及分型非常有意義。我們建立了志賀氏菌屬所有4種Shigella的光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，為其分型檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。細(xì)菌的中紅外光譜具有非常典型的指紋特征，光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立相當(dāng)于為可疑目標(biāo)菌提供了一個(gè)比對(duì)和參考，因此可以大大簡(jiǎn)便細(xì)菌的分類鑒定過(guò)程。在微生物分類鑒定領(lǐng)域，數(shù)據(jù)庫(kù)的概念都是基于其生化代謝特征，基于其光譜建立數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)報(bào)道較少，因此本研究提出的FT-IR光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的概念會(huì)為細(xì)菌的分型及檢測(cè)提供一個(gè)新的思路和研究方向。但是，由于細(xì)菌是活的生命體，其組成成分隨生命狀態(tài)而異，這樣反應(yīng)的光譜特征可能就會(huì)有差異，因此本文建立的光譜數(shù)據(jù)庫(kù)及采集的光譜必須是以統(tǒng)一的樣品制備條件為前提。對(duì)此，前期我們已通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了細(xì)菌濃度、培養(yǎng)條件及加熱滅火等條件對(duì)FT-IR技術(shù)用于細(xì)菌分類鑒定均具有明顯的影響[10]。

本研究應(yīng)用PCA 或HCA 分析方法，建立了4種志賀氏菌的快速分型方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明2種分析方法均能實(shí)現(xiàn)對(duì)4種Shigella的快速分類。其中PCA 分析方法可在確保光譜差異性的前提下將數(shù)據(jù)維數(shù)減少至二維或三維圖，但這可能會(huì)導(dǎo)致原本很好聚類的數(shù)據(jù)點(diǎn)看似發(fā)生“交叉或重疊”，體現(xiàn)在二維或三維圖中就不能成功分類。在多種細(xì)菌數(shù)據(jù)分析時(shí)容易發(fā)生上述情況。但是本研究志賀氏菌屬一共只有4種菌，因此不會(huì)發(fā)生這種情況。HCA以光譜之間的距離作為分類依據(jù)，分類結(jié)果通過(guò)平面樹(shù)狀圖直觀的體現(xiàn)，不會(huì)發(fā)生重疊或交叉問(wèn)題。在實(shí)際微生物分類鑒定中，2種方法可以結(jié)合運(yùn)用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，微生物一定波數(shù)范圍光譜特征與其細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成具有特定對(duì)應(yīng)關(guān)系，在1 800～900 cm-1波數(shù)范圍光譜有3個(gè)“指紋區(qū)域”具有特定吸收，即酰胺區(qū)、混合區(qū)(包括脂肪酸、磷酸化合物和蛋白質(zhì))和多糖區(qū)。從圖1便可看出在這個(gè)區(qū)域4種菌光譜之間具有差異性，另外，結(jié)合我們的分析結(jié)果，本研究選擇1 800～900 cm-1范圍光譜進(jìn)行分析。

為驗(yàn)證所建立數(shù)據(jù)庫(kù)和分型方法的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)從污染樣品分離的可疑菌進(jìn)行了HCA聚類分析。結(jié)果充分說(shuō)明我們應(yīng)用FT-IR技術(shù)建立的方法可以準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)4種志賀氏菌的準(zhǔn)確快速分型。與傳統(tǒng)表型方法及分子生物學(xué)分型方法相比，該方法大大簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，從采集光譜到數(shù)據(jù)分析1小時(shí)內(nèi)便可完成。這為志賀氏菌臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、食物中毒的預(yù)警和溯源、食品中志賀氏菌檢測(cè)及醫(yī)院感染監(jiān)控，志賀氏菌的分型與檢測(cè)提供了一種有效的工具，也為其他致病菌的分型研究提供了一種新的思路。但是，作為一種分型技術(shù)，本研究建立的分型技術(shù)僅僅是對(duì)志賀氏菌屬“四大類”志賀氏菌進(jìn)行了“粗分”。而每一種志賀氏菌又有若干血清型，對(duì)不同的血清型進(jìn)行“細(xì)分”，或許這將是FT-IR技術(shù)用于分型研究未來(lái)的工作。

[1] 任慧婧, 劉蕓, 王美會(huì)， 等. 志賀氏菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè), 2015, 7: 49-50.

Ren H J, Liu Y, Wang M H, et al. The advancement on detection methods forShigella[J]. Henan Agriculture, 2015, 7: 49-50.

[2] 管峰, 楊季芳. 食源性致病菌溯源分型技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 浙江萬(wàn)里學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 4: 96-100.

Guan F, Yang J F. Study on typing of foodborne pathogens tracking[J]. Journal of Zhejing Wanli University, 2012, 4: 96-100.

[3] 王慶忠, 婁崢, 宣瑛. 病原菌分子分型方法研究進(jìn)展[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2009, 24(5): 397-400.

Wang Q Z, Lou Z, Xuan Y. Stydy on molecular typing methods for pathogens[J]. Laboratory Medicine, 2009, 24(5): 397-400.

[4] Naumann, D. Some ultrastructural information on intact, living bacterial cells and related cell-wall fragments as given by FTIR[J].Infrared Physics and Technology, 1984(24): 233-238.

[5] Naumanan D, Helm D, Labischinski H. Microbiological characterization by FT-IR spectroscopy[J]. Nature, 1991(351): 6321-6381.

[6] Helm D, Labischinski H, Schallehn G, et al. Classification and identification of bacteria by fourier transform infrared spectroscopy[J]. Journal of Genaral and Applied Microbiology, 1991a(137): 69-79.

[7] Helm D. Labischinski H. Naumann D. Elaboration of a procedure for identification of bacteria using fourier transform IR spectral libraries: A stepwise correlation approach[J]. Jouranl of Microbiological Methods, 1991b(14): 127-142.

[8] Jaurequiberry M, Madoz L V, Giuliodori M J, et al. Identification of Escherichia coli and Trueperella pyogenes isolated from the uterus of dairy cows using routine bacteriological testing and fourier transform infrared spectroscopy[J]. Acta Veterinaria Scandinavica, 2016, 58(1): 81.

[9] Johler S, Stephan R, Althaus D, et al. High-resolution subtyping of Staphylococcus aureus strains by means of Fourier-transform infrared spectroscopy[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2016, 39(3): 189-194.

[10] 楊麗君, 王靜, 李兆杰等. 傅立葉變換紅外光譜技術(shù)用于細(xì)菌檢測(cè)的影響因素研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(8): 190-194.

Yang L J, Wang J, Li Z J, ea tl. Several factors for the detection of bacteria by FT-IR spectroscopy[J], Food Science,2013, 34(8): 190-194.

[11] 王靜, 楊麗君, 李兆杰等. 傅立葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)兩株大腸桿菌的鑒別[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2012, 39(2): 1844-1850.

Wang J, Yang L J, Li Z J, ea tl. Differentiation of two strains ofEscherichiacoliby FT-IR spectroscopy[J], Microbiology China, 2012, 39(2): 1844-1850.

[12] 楊麗君, 李兆杰, 宋曉華等. 傅立葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)5 種沙門(mén)氏菌的快速分類鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2013, 40(2): 373-379.

Yang L J, Li Z J, Song X H, et al. Rapid differentiation and identification of five species ofSalmonellaby FT-IR spectroscopy[J]. Microbiology China, 2013, 40(2): 373-379.

[13] 楊麗君, 李兆杰, 王靜等. 傅立葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)3種李斯特氏菌的快速分類鑒定[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 32(2): 169-173.

Yang L J, Li Z J, Wang J, ea al. Rapid differentiation and identification of three species ofListeriaby FT-IR spectroscopy[J]. Journal of Food Science and Biotechnology, 2013, 32(2):169-173.

[14] Lin M, Al-Holy M, Chang SS, et al. Rapid discrimination ofAlicyclobacillusstrains in apple juice by fourier transform infrared spectroscopy[J]. International Journal of Food Microbiology, 2005(105): 369-376.

[15] Rodriguez-Saona LE, Khambaty FM, Fry FS, et al. Rapid detection and identification of bacterial strains by fourier transform nearinfrared spectroscopy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001(49): 574-579.

[16] Dziuba B, Babuchowski A, Nalecz D, et al. Identification of lactic acid bacterica using FTIR spectroscopy and cluster analysis[J]. International Dairy Journal, 2007(17): 183-189.

[17] Al-Qadiri HM, Lin M, Cavinato AG, et al. Fourier transform infrared spectroscopy, detection and identification ofEscherichiacoliO157:H7 andAlicyclobacillusstrains in apple juice[J]. International Journal of Food Microbiology, 2006(111): 73-80.

責(zé)任編輯 高 蓓

RapidTypingMethodforFourSpeciesofShigellabyFT-IRSpectroscopy

LI Zhao-Jie1, ZHANG Yu-Chun1, LIU Yu-Min1, JIANG Yan-Hua2, WANG Xiu-Jie1, GU Hua-Zhen1, LI Zheng-Yi3, YANG Li-Jun1

(1.Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Weihai 264205, China； 2. Yellow Sea Fisheries Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China)

The fingerprint absorption spectra from 4 000～600 cm-1of four species ofShigellaincludingS.dysenteriae,S.flexneri,S.boydiiandS.sonneiwere collected by FT-IR spcetroscopy, treated by baseline correction, vector normalization, and so on. The spectra data from 1 800～900 cm-1were analyzed by two unsupervised methods of principal component analysis (PCA) and hierarchical cluster analysis (HCA) respectively to establish a rapid typing method for four species ofShigella. The spectra data library and the typing method established here were tested by HCA of targetS.sonnei,S.enteritidisandE.coliseperated from contaminated pork. It was shown that a standard FT-IR spectral data library including four species ofShigellawas established and could be used for the rapid typing ofShigella. Furthermore, the two methods of PCA and HCA could give good seperation of the four bacteria. The PCA and HCA results proved that the region over the range of 1 800～900 cm-1exhibited the most representative differences, which contains three “fingerprint regions” having unique absorption, called the amide region, the mixed region and the polysaccharide region, respectively. It was also revealed that the clustering pattern obtained from HCA was in agreement with the classification obtained using PCA, indicating that the FT-IR-based methods can deliver consistent classification in spite of the multivatiate statistical analysis used. The spectra data of targetS.sonneifrom contaminated pork was clusterd successfully in theS.sonneicluster of the spectra data library, but those ofS.enteritidisandE.coliwas clustered alonely. These results demonstrate that FT-IR spectroscopy technology combined multivariate statistical analysis is a good typing method for four species ofShigella. This study may provide a rapid, accurate and easy method for typing ofShigella, especially suitable for the basic laboratories of CDC and port quarantine departments to perform suiveillance and epidemiological traceability ofShigella.

Fourier transform infrared spectroscopy;Shigella; typing; PCA; HCA

Q31

A

1672-5174(2018)01-057-06

10.16441/j.cnki.hdxb. 20160378

李兆杰，張玉春，劉玉敏, 等. 傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)4種志賀氏菌快速分型的研究[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2018, 48(1): 57-62.

LI Zhao-Jie, ZHANG Yu-Chun, LIU Yu-Min, et al. Rapid Typing method for four species ofShigellaby FT-IR spectroscopy [J]. Periodical of Ocean University of China, 2018, 48(1): 57-62.

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研項(xiàng)目(2015IK204；2015IK203)資助

Supported by Science and Technology Projects of General Administration of Quality Supervision , Inspection and Quarantine of the People′s Republic of China (2015IK204；2015IK203)

2016-11-07;

2016-12-19

李兆杰(1981-)，男，博士生，高級(jí)工程師，主要從事食品安全檢測(cè)及方法開(kāi)發(fā)研究。E-mail：hunterlee_81@163.com