牙鲆原代腎細胞培養(yǎng)及其對牙鲆彈狀病毒的易感性研究?

張家林， 唐小千， 繩秀珍， 邢 婧， 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學水產(chǎn)學院水產(chǎn)動物病害與免疫實驗室，山東 青島 266003)

牙鲆原代腎細胞培養(yǎng)及其對牙鲆彈狀病毒的易感性研究?

張家林， 唐小千**， 繩秀珍， 邢 婧， 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學水產(chǎn)學院水產(chǎn)動物病害與免疫實驗室，山東 青島 266003)

為探索牙鲆彈狀病毒(HIRRV)對敏感宿主牙鲆腎臟原代細胞的敏感性，本研究分別采用組織塊移植法和胰酶消化法對牙鲆(Paralichthysolivaceus)腎臟細胞進行分離和原代培養(yǎng)。研究顯示，采用組織塊移植法進行培養(yǎng)后，會出現(xiàn)較多的成纖維樣細胞，而采用胰酶消化法進行培養(yǎng)后，細胞呈現(xiàn)上皮細胞樣且形態(tài)完整，7天后細胞的匯合率可達80%。采用胰酶消化法對牙鲆腎細胞進行原代培養(yǎng)，傳代后進行病毒敏感性實驗，實驗表明牙鲆腎細胞接種HIRRV后，第3天出現(xiàn)了明顯的CPE，病毒滴度達1×105.8TCID50/mL；RT-PCR可從感染3天的細胞培養(yǎng)物中檢測到HIRRV的特異性mRNA；利用抗HIRRV單克隆抗體結(jié)合免疫熒光試驗可從感染24 h的細胞中檢測到特異性熒光信號，信號分布在細胞膜和細胞質(zhì)中。研究結(jié)果表明，基于胰酶消化法建立的牙鲆腎臟原代細胞對HIRRV較敏感，HIRRV可成功侵染該細胞并在細胞內(nèi)實現(xiàn)快速增殖。本研究為牙鲆彈狀病毒的致病機制研究提供了材料和實驗基礎。

牙鲆；原代細胞培養(yǎng)；胰酶消化法；牙鲆彈狀病毒；敏感性

牙鲆彈狀病毒(Hirame rhabdovirus, HIRRV)是一種重要的魚類彈狀病毒，主要感染牙鲆(Paralichthysolivaceus)、香魚(Plecoglossusaltivelis)、石鰈(Kareiusbicoloratus)、黑鯛(Myliomacrocephalus)、茴魚(Thymallusthymallus)、花鱸(Lateolabraxmacu-latus)等魚類[1-5]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。感染魚的癥狀主要表現(xiàn)為鰭基充血，肌肉組織及內(nèi)部器官出血，造血器官壞死，死亡率高達60%[6]。該病毒主要在中國、日本和韓國等冬季冷水區(qū)域流行，歐洲的波蘭等地也有該病毒的分離報道[4]。該病毒具有傳染性強、死亡率高的特點，嚴重威脅我國鲆鰈魚類的健康養(yǎng)殖。然而，目前市場上缺少有效的治療藥物和預防性疫苗。因此，亟需對該病毒的毒力特性及其致病機理等方面進行深入的研究。

牙鲆隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes) 鰈型目(Pleuronetiformes) 鲆科(Bothidea)，具有經(jīng)濟價值好、營養(yǎng)價值高的特點，迅速成為我國黃、渤海地區(qū)的主要經(jīng)濟性魚類。隨著集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高，養(yǎng)殖環(huán)境越來越惡劣，養(yǎng)殖魚類的病害問題也日漸突出，這成為了限制我國牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的難題。細胞培養(yǎng)分離技術(shù)是病毒生物學研究中應用最為廣泛的技術(shù)之一，但來源于牙鲆的細胞資源較少，已知的細胞系只有牙鲆胚胎細胞系(HINAE)和牙鲆鰓細胞系(FG)[7]。然而HIRRV在這2種細胞系上的滴度較低，在HIRRV的致病機理研究中存在一定的局限性。此外，研究表明多種彈狀病毒通過血液循環(huán)擴散到全身各組織中[8]，且腎臟是魚類的造血器官，推測腎臟可能是一種良好的細胞來源。結(jié)合國外的研究工作，本文進行了牙鲆腎臟細胞的分離、原代培養(yǎng)和對HIRRV的敏感性研究，為進一步研究牙鲆彈狀病毒的致病機理提供細胞模型和材料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚與毒株

健康牙鲆((20±5) g)購自日照順源水產(chǎn)育苗有限公司，游動正常，無臨床癥狀。 蓄養(yǎng)于40 cm×40 cm×40 cm室內(nèi)水槽內(nèi)，水溫(15 ± 1)℃，期間不間斷充氣。暫養(yǎng)7天后對可能存在的細菌、寄生蟲進行常規(guī)檢測，參考Sun等[10]，采用PCR法進行HIRRV的檢測，確認實驗用魚不攜帶病原體后用于后續(xù)實驗。牙鲆彈狀病毒CNPo2015株為本實驗室保存。

1.2 組織塊移植法原代培養(yǎng)

牙鲆原代細胞培養(yǎng)參照付思思等[9]采用組織塊移植法進行并適當改進。將健康牙鲆浸于含有0.5 mg/kg的高錳酸鉀溶液的水槽中消毒30 min，使用80 mg/L的MS-222進行麻醉，75%酒精浸泡魚體數(shù)分鐘進行消毒，將魚體置于Ⅱ級生物安全柜內(nèi)，用眼科剪將中腎剪成約1 mm3的組織塊，用含高濃度抗生素的PBS緩沖液(500 U/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL 兩性霉素B) 清洗3次，然后將組織塊轉(zhuǎn)移到25 cm2細胞培養(yǎng)瓶 (Corning，USA) 中，使其均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底面，倒置平放于20 ℃的CO2培養(yǎng)箱中貼附3 h。加入含有20%胎牛血清 (FBS, Gibco)的L15培養(yǎng)基中(含200 U/mL青霉素、200 μg/mL鏈霉素、5 μg/mL兩性霉素B)，置于20 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后更換新鮮培養(yǎng)基以去除殘余紅細胞和其它未貼壁細胞。倒置顯微鏡下每天觀察細胞生長情況及形態(tài)變化。

1.3 胰酶消化法原代培養(yǎng)

胰酶消化法原代培養(yǎng)參考王光祥等[10]的方法加以改進。將牙鲆進行消毒后，無菌條件下取出腎臟。用眼科剪將中腎剪成約1 mm3的組織塊，加入1 mL的已預熱的胰蛋白酶中，37 ℃水浴輕搖消化，每隔2 min后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至1 mL的 L15培養(yǎng)基中，組織塊繼續(xù)加入新鮮胰酶進行消化，直至沒有較大組織塊為止，收集消化產(chǎn)物，1 000 r/min離心10 min后，棄上清，用新鮮的含20% FBS的L15培養(yǎng)基輕微吹打，至沒有細胞結(jié)塊為止。然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，置于20 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。

1.4 傳代培養(yǎng)

當細胞遷出匯合率可達80%后，小心棄去舊培養(yǎng)基，用含有0.1 mol/L的PBS緩沖液清洗3次，加入1 mL 0.25% EDTA-胰蛋白酶進行消化，待80%細胞收縮變圓時，加入5 mL培養(yǎng)基終止消化，小心吹打使細胞脫落后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min離心5 min，加入含有10% FBS的L15培養(yǎng)基后，置于20 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 HIRRV感染實驗

當連續(xù)傳代5次后，選擇生長良好的牙鲆腎細胞單層，按5%的比例接種HIRRV CNPo2015株。室溫下吸附2 h，期間每間隔30 min輕微晃動培養(yǎng)瓶1次以便均勻吸附。棄去毒液，加入含4% FBS的L15細胞維持液，15 ℃培養(yǎng)觀察。待細胞病變75%以上時，收獲病毒液，將上述細胞病毒液用L15細胞培養(yǎng)液按10倍系列稀釋至10-8, 在96孔細胞培養(yǎng)板(Corning)中微量法測定病毒的滴度, 用Reed-Muench法計算TCID50。

1.6 PCR實驗

收集HIRRV感染后第4天的細胞培養(yǎng)物，Trizol法抽提總RNA，采用PrimeScript RT Reagent Kit (Takara)進行反轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的牙鲆彈狀病毒CNPo2015株G基因序列(登錄號: KY363350)，使用Sun等[10]的HIRRV特異性引物進行RT-PCR擴增，HIRRV毒種作為陽性對照。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并送至生工(上海)進行測序。

1.7 免疫熒光檢測

取1×106個細胞接種在24孔細胞爬片(Solarbio)上培養(yǎng)，待細胞貼壁后接種0.1 mol的HIRRV，24 h后小心地取出爬片，PBS清洗2次后，加入丙酮中4 ℃固定30 min，自然風干后，加入PBS(含0.5%的Tween 20) 洗滌3次，加入本實驗室制備的抗HIRRV-G蛋白的單克隆抗體，37 ℃孵育1 h，洗滌3次后加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠Ig G (Sigma)，37 ℃孵育45 min。洗滌3次后加入DAPI染核5 min，洗滌3次后用抗熒光衰減淬滅劑(Solarbio)封片，在熒光顯微鏡下鏡檢。同時，收集感染24 h后的腎臟細胞，吸取30 μL細胞懸液滴于干凈的載玻片上，丙酮固定15 min后風干，免疫熒光法確定感染細胞的比例。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆腎臟原代細胞的培養(yǎng)和生長特性

采用組織塊移植法培養(yǎng)牙鲆腎臟細胞1天后，一部分梭形的腎臟細胞開始遷出，少數(shù)細胞游離，無細胞集結(jié)成團的現(xiàn)象(見圖1a)，貼壁細胞緩慢生長至第7天后匯合率達到60%以上，大部分細胞鋪展呈成纖維樣，少數(shù)細胞呈上皮細胞樣(見圖1b)，傳代后上皮細胞樣細胞漸漸消失。采用胰酶消化法培養(yǎng)牙鲆腎臟細胞1天后，細胞形態(tài)完整，較多細胞開始貼壁，細胞體積變大，拉長，呈上皮細胞樣(見圖1c)。培養(yǎng)7天后，單層細胞約占瓶底面積80%以上(見圖1d)。

2.2 牙鲆腎臟細胞感染HIRRV后的形態(tài)學變化

用HIRRV CNPo2015株感染牙鲆腎細胞。當感染2天后，腎臟細胞未出現(xiàn)明顯變化。當感染3天后，與感染前(見圖2a)相比，細胞開始收縮變圓、折光度增加，細胞脫落，單層細胞呈拉網(wǎng)狀，出現(xiàn)典型細胞病變效應(見圖2b)，采用微量板細胞病變法測定病毒滴度為1×105.8TCID50/mL。

(A.組織塊移植法培養(yǎng)1天后的腎臟細胞，100×；b.組織塊移植法培養(yǎng)7天后的腎臟細胞，200×；c.胰酶消化法培養(yǎng)1天后的腎臟細胞，200×；d.胰酶消化法培養(yǎng)7天后的腎臟細胞，200×。a.Flounder kidney cells at 1 day post-culture by tissue transplantation, 100×; b.Flounder kidney cells at 7 days post-culture by tissue transplantation, 200×; c.Flounder kidney cells at 1 day post-culture by trypsinization, 200×; d.Flounder kidney cells at 7 days post-culture by trypsinization, 200×.)

圖1 牙鲆腎臟細胞的原代培養(yǎng)

Fig.1 Primary culture of Japanese flounder kidney cells

(A.HIRRV感染前的腎臟細胞, 200×；b.HIRRV感染后的腎臟細胞, 200×。a.Kidney cells before HIRRV inoculation, 200×; b.Kidney cells after HIRRV inoculation, 200×.)

圖2 接種HIRRV前、后腎細胞的變化

Fig.2 The changes in flounder kidney cells before or after being inoculated with HIRRV

2.3 HIRRV G基因在牙鲆腎臟細胞中的檢測

HIRRV感染腎臟細胞3天后，使用HIRRV-G特異性引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后獲得了大小約為515 bp的片段，與陽性對照的大小一致(見圖3)。產(chǎn)物經(jīng)測序后提交到BLAST進行比對后，與HIRRV G基因的核酸序列相似性為100%。

(1.DNA標準DL2000; 2.擴增產(chǎn)物; 3.陽性對照。1. DNA marker DL2000; 2. PCR product of HIRRV in kidney cells; 3. Positive control.)

圖3 RT-PCR檢測結(jié)果

Fig.3 RT-PCR amplified results

2.4 間接免疫熒光檢測

采用抗HIRRV-G蛋白的單克隆抗體進行間接熒光染色。病毒接種24 h后，檢測到 HIRRV在牙鲆腎細胞上增殖。熒光信號分布在細胞膜和細胞質(zhì)中，且細胞膜上出現(xiàn)的熒光信號更加強烈(見圖4 a和b)。通過對10個視野的計數(shù)統(tǒng)計，約有30%的腎細胞出現(xiàn)了較強熒光信號(見圖4c和d)。

3 討論

近年來，HIRRV的爆發(fā)越來越頻繁，給全球的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。自2010年我國首次分離和鑒定到HIRRV病毒以來，尚沒有流行爆發(fā)的報道，但不排除這種可能[12]。由于該病毒具有持續(xù)感染的特性，了解病毒的致病機制是進行病毒防控的關鍵。研究表明用體外細胞模型進行病毒感染試驗時，試驗過程更容易重復，可獲得更加準確的實驗結(jié)果[13]。同時，體外培養(yǎng)的組織細胞能夠保持其在體內(nèi)原有的許多結(jié)構(gòu)和功能，并排除了神經(jīng)、體液等因素的干擾[14], 因此體外培養(yǎng)在牙鲆彈狀病毒的致病機制研究中具有重要意義。

魚類細胞原代培養(yǎng)的方法主要由組織塊遷移法和胰酶消化法[15]。組織塊遷移法適用于各種組織的原代培養(yǎng)。本實驗中，采用組織塊遷移法對牙鲆腎臟細胞進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)腎細胞的遷出速度較慢，形成較多的成纖維樣細胞，推測是由于牙鲆腎臟的組織結(jié)構(gòu)較松散，含有許多疏松結(jié)締組織，其中含有大量成纖維細胞[16]。

(a，b.腎臟細胞爬片的FITC和DAPI染色結(jié)果，1000×；c，d.腎臟細胞滴片的FITC和DAPI染色結(jié)果，1000×。a,b.FITC and DAPI stainings on kidney cell climing slices, 1000×.; c,d.FITC and DAPI stainings on kidney cell slices, 1000×.)

圖4 HIRRV感染牙鲆腎臟細胞后的免疫熒光結(jié)果

Fig.4 Results of immunofluorescence in HIRRV-infected flounder kidney cells

在原代培養(yǎng)過程中由于成纖維樣細胞比上皮樣細胞的貼壁能力更強，最終導致了上皮樣細胞死亡。但成纖維樣細胞增殖能力較弱，不適合進行長期傳代。采用胰酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)時，常采用0.05%～0.25%濃度的胰酶。濃度過低，會造成組織消化不足，細胞難以貼壁，而濃度過高，會使細胞死亡率增加或喪失貼壁能力[17]。我們通過進行優(yōu)化，每消化2 min后吸出解離的細胞，盡可能地減少胰酶對細胞的損傷。傳統(tǒng)的胰酶消化法是將組織塊消化成細胞懸液，我們發(fā)現(xiàn)隨著消化時間的延長，細胞活力呈下降趨勢，且單個細胞貼壁能力較弱。因此，我們將組織塊消化成一些小細胞團，這些小細胞團的貼壁能力比單個細胞更強，細胞產(chǎn)量和細胞活力也較理想。目前，腎細胞已經(jīng)連續(xù)傳代10次，但原代培養(yǎng)的細胞在傳代后貼壁能力和增殖速度都有所降低，這可能是由于細胞在傳代后分泌的粘附因子較少，又不能充分利用血清中的貼壁因子。因此，我們考慮加入生長因子和促有絲分裂原等藥物進行優(yōu)化。

在前期的HIRRV致病性研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIRRV在腎臟、脾臟等組織中含量較高，因此我們著重探討原代腎細胞對HIRRV的易感性。結(jié)果表明牙鲆腎細胞感染HIRRV后3天出現(xiàn)了明顯的CPE，病毒滴度最終穩(wěn)定在1×105.8TCID50/mL，證明此細胞系對HIRRV較敏感，RT-PCR也檢測到了HIRRV的特異性mRNA。同時，應用抗HIRRV-G蛋白的單抗進行間接免疫熒光試驗后，HIRRV感染24 h后細胞中出現(xiàn)了特異性的熒光信號，信號分布在細胞膜和細胞質(zhì)中。通常，病毒蛋白的合成和加工主要是在細胞質(zhì)中利用細胞資源進行，所以在感染細胞的細胞質(zhì)中出現(xiàn)了熒光信號。此外，我們發(fā)現(xiàn)在細胞膜上出現(xiàn)了一些強烈的信號。研究表明G蛋白是病毒囊膜上的主要糖蛋白，可與細胞表面的受體結(jié)合，從而介導病毒吸附和入胞[18]。細胞膜上出現(xiàn)了零散的強烈信號，這些位點可能是G蛋白和細胞膜上受體結(jié)合的部位，說明牙鲆腎細胞膜上含有較多的HIRRV受體，進一步表明了該細胞對HIRRV具有較強的敏感性。

4 結(jié)論

本文建立了牙鲆原代腎細胞的培養(yǎng)方法，并證明了牙鲆原代腎細胞對HIRRV具有較強的敏感性，為進一步研究HIRRV的致病機制提供了較理想的細胞模型和實驗基礎。

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責任編輯 朱寶象

研究簡報

PrimaryCellCultureofJapaneseFlounder(Paralichthysolivaceus)KidneyandDeterminationofTheirSusceptibilitytoHirameRhabdovirus

ZHANG Jia-Lin, TANG Xiao-Qian, SHENG Xiu-Zhen, XING Jing, ZHAN Wen-Bin

(Laboratory of Pathology and Immunology of Aquatic Animals, College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

To explore the susceptibility of the cultured primary kidney cells of Japanese flounder (Paralichthysolivaceus) to hirame rhabdovirus (HIRRV), the primary kidney cells of Japanese flounder were isolated and cultured using tissue transplantation and trypsinization techniques, respectively. The results showed that the morphology of the kidney cells was mainly fibroblast-like as were observed with tissue transplantation method, while they were epithelial-like as were observed with trypsinization method. The cell confluence rate was 80% at 7 days post-culture. The virus susceptibility tests were carried out after cell passage. Viral-induced cytopathic effect was observed, and the viral titer reached about 105.8TCID50/mL at 3 days post HIRRV infection. RT-PCR detected the mRNA of HIRRV in infected cells. Using monoclonal antibody against HIRRV and indirect immune fluorescent techniques, specific fluorescence signal was detected in the infected cells at 24 h post infection. The signal located in cell membrane and cytoplasm. Our findings suggested that the kidney cells were susceptible to HIRRV; the virus could successfully infect and proliferate rapidly in the cells. The primary kidney cell culture of Japanese flounder was established in this study, which will provide useful materials for the pathogenic mechanism studies of HIRRV.

Paralichthysolivaceus; primary cell culture; trypsinization; HIRRV; susceptibility

S91

A

1672-5174(2018)01-019-06

10.16441/j.cnki.hdxb. 20170038

張家林， 唐小千， 繩秀珍， 等. 牙鲆原代腎細胞培養(yǎng)及其對牙鲆彈狀病毒的易感性研究[J].中國海洋大學學報(自然科學版),2018, 48(1): 19-24.

ZHANG Jia-Lin, TANG Xiao-Qian, SHENG Xiu-Zhen, et al. Primary cell culture of Japanese flounder (Paralichthysolivaceus) kidney and determination of their susceptibility to hirame rhabdovirus [J].Periodical of Ocean University of China, 2018, 48(1): 19-24.

國家自然科學基金項目(31672685; 31672684; 3142295)；海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室開放基金項目資助

Supported by National Natural Science Foundation of China (31672685; 31672684; 3142295);The Open Foundation of Functional Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes

2017-01-20；

2017-03-21

張家林(1988-)，男，博士生，主要從事水產(chǎn)動物病害與免疫學研究。

?? 通訊作者：E-mail：tangxq@ouc.edu.cn