高效液相色譜—串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法檢測安神類保健食品中非法添加物

康 寧高媛惠高利珍

KANG Ning1，2 GAO Yuan-hui2 GAO Li-zhen1

(1. 太原理工大學(xué)，山西 太原 030024；2. 中華人民共和國太原海關(guān)，山西 太原 030024)

(1. Taiyuan University of Technology, Taiyuan, Shanxi 030024, China; 2. Taiyuan Customs District, Taiyuan, Shanxi 030024, China)

保健食品屬于食品的一個分支，能調(diào)節(jié)人體的機(jī)能，適用于特定人群使用，但不以治療疾病為目的[1-2]。隨著公眾健康保健意識的不斷增強，對保健食品的需求十分旺盛。為了使保健品達(dá)到宣傳的預(yù)期效果，不法企業(yè)選擇向保健品中添加具有治療效果的藥物[3-4]，以此來賺取高額利潤。目前保健食品中呈現(xiàn)出的非法化學(xué)藥物添加，有以下現(xiàn)象：添加物的來源不明[5-8]，非法添加藥物的劑量隨意[9]，非法添加藥物的兼容性不明確[10]；而且非法添加現(xiàn)象較為嚴(yán)重。如果消費者長期服用這些含有違禁化學(xué)物質(zhì)的保健食品，會直接影響身體健康，極大地?fù)p害了消費者的身心健康和經(jīng)濟(jì)利益。

近年來，對于降壓類、降糖類及減肥類等保健品中非法添加物的研究進(jìn)展較多[11-13]，國內(nèi)外文獻(xiàn)對安神類保健品非法添加的研究也有報道[14-16]。目前中國食藥總局發(fā)布了保健食品中非法添加物目錄，其中青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素5種在名單內(nèi)，都屬于國家嚴(yán)格監(jiān)管的一類藥品，如果使用不當(dāng)或濫用將造成嚴(yán)重不良后果，如出現(xiàn)困倦、乏力、頭暈，嚴(yán)重時還可能導(dǎo)致昏迷[17]。然而，目前對青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素等5種安神類藥物作為保健品的非法添加物的檢測方法尚未見到，僅有對藥物本身檢測方法的研究[18-22]。

液相色譜—串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法(LC-Q-TOF-MS)是近幾年發(fā)展起來的一種高端串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，在藥物分析、食品分析、環(huán)境分析等眾多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[23-24]，高分辨質(zhì)譜儀較低分辨質(zhì)譜儀分析速度快、靈敏度高、分辨率高、選擇性強，特別是對于復(fù)雜樣品的分析與鑒定有不可替代的作用。目前對上述5種安神類藥物的研究均采用的是普通液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，尚未見高分辨質(zhì)譜儀應(yīng)用于保健品中非法添加檢測方法的研究[25-27]。

本研究擬采用LC-Q-TOF-MS檢測安神類保健食品中的非法添加物，并探索試驗條件及優(yōu)化檢測參數(shù)設(shè)定，以期建立出一種快速、高效、靈敏的安神類保健食品中非法添加物(青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素)的檢測方法，為中國保健食品中違法添加安神類藥物提供檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

改善睡眠類的保健食品：膠囊A (0.35 g/粒)、口服液B(15 mL/支)、膠囊C(0.5 g/粒)、膠囊D(0.5 g/粒)、茶劑E(4 g/袋)、膠囊F(0.35 g/粒)，研碎，盡量使樣品均勻，正規(guī)藥店購買；

乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher 公司；

乙酸銨：分析純，天津市化學(xué)試劑廠；

試驗用水均為去離子水；

試驗所需的標(biāo)準(zhǔn)品及其相關(guān)信息如表1所示。

表1 5種化合物標(biāo)準(zhǔn)品及其相關(guān)信息

1.2 主要儀器設(shè)備

液相色譜儀：Agilent Technologies 1290型，美國安捷倫科技有限公司；

飛行時間質(zhì)譜儀：Agilent Technologies 6540型，美國安捷倫科技有限公司；

電子分析天平：XS204型，瑞士Mettler公司；

渦旋混合器：945617型，美國TALBOYS公司；

超聲波：KQ-500DB型，昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 定性分析中色譜條件的優(yōu)化

(1) 1 000 mg/L非法添加物單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別稱取按質(zhì)量折算為100%的標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥ 99.2%)10.00 mg于10 mL的容量瓶中，青藤堿、文拉法辛、扎來普隆用甲醇溶解并稀釋至刻度，羅通定用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，褪黑素用70%甲醇溶解并稀釋至刻度，將配置好的各個單標(biāo)準(zhǔn)溶液于-18 ℃下保存。

(2) 1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液：移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇溶液配置，再用甲醇稀釋成10，100，500，800，1 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液。選擇 Agilent C18色譜柱(1.9 μm，2.1 mm×50 mm)；將提前配制的 5 種非法添加物(青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素)的混標(biāo)溶液進(jìn)樣，流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；按表 2 進(jìn)行梯度洗脫；流動相 A 為甲醇，流動相 B 分別設(shè)定為水、0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液、含 20 mmol/L乙酸銨的0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液外，其他條件同1.3.1(1)，進(jìn)行3次試驗，選擇 5 種化合物響應(yīng)值最高的為試驗所選B路流動相。

表2 梯度洗脫程序

1.3.2 定性分析中質(zhì)譜條件的優(yōu)化 離子源為電噴霧離子化器(ESI)；檢測方式為正離子；離子源噴射電壓5.5 kV，毛細(xì)管電壓135 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h。掃描方式為一級、二級全掃描，全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的一級母離子精確質(zhì)量數(shù)，以及二級定性離子對的精確質(zhì)量數(shù)。

1.3.3 定量分析方法

(1) 檢出限和定量限：取1 mg/L的5種非法添加物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液，用甲醇稀釋成一定質(zhì)量濃度的溶液后測定各化合物的信噪比，依據(jù)檢出限為3倍信噪比(S/N=3)，定量限為10倍信噪比(S/N=10)，計算出該方法的檢出限和定量限。

(2) 線性關(guān)系考察：取安神類非法添加物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋配制成濃度梯度溶液為10，100，500，800，1 000 μg/L，濃度由低至高依次進(jìn)行LC-Q-TOF/MS分析。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3) 回收率和精確度：取空白的陰性樣品1.0 g于3支50 mL離心管中，并在每支試管中分別加入適量的羅通定、青藤堿、文拉法辛、褪黑素、扎來普隆，用甲醇稀釋至10 mL，配制成含有這5種非法添加物濃度為10.0，50.0，100.0 μg/L 3個加標(biāo)溶液，超聲20 min，靜置10 min后，取其上清液過0.22 μm 微孔濾膜，然后進(jìn)入該儀器進(jìn)行分析，平行測定6次。根據(jù)外標(biāo)法計算這5種非法添加物的回收率，并計算該方法的精確度。

1.3.4 樣品含量的測定

(1) 樣品預(yù)處理：對于膠囊劑，取10粒膠囊，取出內(nèi)容物，將膠囊殼剪碎，與內(nèi)容物混勻并研磨；對于茶劑，取少量進(jìn)行研磨；對于口服制劑，量取1次口服劑量。

(2) 樣品提?。簻?zhǔn)確稱取1.00 g(精確至 0.01 g)試樣至50 mL離心管中，加入10.00 mL甲醇溶液超聲提取20 min，靜止10 min后，取上層清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

(3) 根據(jù)試驗所建立的方法，對待測樣品中的 5 種非法添加物進(jìn)行定性定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析中檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的優(yōu)化 由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)電離，因此流動相的組成和添加劑除了影響分析物的保留時間和峰形外，還會影響分析物的離子化效率，從而影響到目標(biāo)化合物的檢測靈敏度。本試驗分別采用甲醇和水，甲醇和 0.1%甲酸，甲醇和含20 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸溶液作為流動相，考察不同流動相組成對分析物峰形及離子化效率的影響，5 種化合物在不同流動相的條件下所對應(yīng)的響應(yīng)值見表 3。如圖 1 所示，圖1(c)中青藤堿的峰形最好、響應(yīng)值最高，因此青藤堿的流動相選甲醇和含20 mmol 乙酸銨的0.1%甲酸溶液。而羅通定、文拉法辛、扎來普隆在3種不同流動相下的色譜圖分析結(jié)果同青藤堿類似，因此，羅通定、青藤堿、文拉法辛、扎來普隆的流動相都選用甲醇和含20 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸溶液。

由圖2可知，褪黑素在后2個圖中峰形不夠好，但仍然是在圖2(c)中響應(yīng)值最高，因此褪黑素的流動相依然選擇甲醇和含20 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸溶液。

圖1 青藤堿在3種流動相條件下的色譜圖

圖2 褪黑素在3種流動相條件下的色譜圖

由3可知，0.1%甲酸溶液和含20 mmol/L乙酸銨的0.1% 甲酸溶液作為流動相B 時，5 種非法添加物的響應(yīng)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以水為流動相B的；而含20 mmol/L 乙酸銨的0.1% 甲酸溶液又比0.1% 甲酸溶液的響應(yīng)值較好。因此對5種非法添加物的流動相都選用甲醇和含20 mmol/L乙酸銨的0.1%的甲酸溶液。

2.1.2 碰撞能量的優(yōu)化 碰撞能量對一級母離子打碎成為二級質(zhì)譜離子起著至關(guān)重要的作用，通過改變碰撞能量的大小，使得母離子以不同的動能與碰撞池中的碰撞氣相撞，動能轉(zhuǎn)化為內(nèi)能，轉(zhuǎn)化的越多，越有利于母離子打碎。對每一種化合物來說，其母離子只能打碎成一些特定的二級質(zhì)譜離子，在這些碎片離子中，找出該化合物的2個響應(yīng)值最高的二級碎片離子，作為該化合物的特征離子對，即該化合物的定性離子對。

表3 5種非法添加物在3種流動相B下對應(yīng)的響應(yīng)值

在離子源為電噴霧離子化器(ESI)；檢測方式為正離子；離子源噴射電壓 5.5 kV，毛細(xì)管電壓 135 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h。錐孔電壓135 kV和碰撞能量(10～35 eV)進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過一級、二級全掃描模式，全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的一級母離子精確質(zhì)量數(shù)，以及二級定性離子對的精確質(zhì)量數(shù)。通過對試驗過程中的碰撞能量進(jìn)行梯度設(shè)定，檢測目標(biāo)化合物的定性離子對響應(yīng)值最高時碰撞能量，例如青藤堿在不同的碰撞能量梯度下的二級質(zhì)譜圖見圖 3。

圖3 青藤堿在碰撞能量梯度下的二級質(zhì)譜圖

從圖3可以看出，隨著碰撞能量的增加，青藤堿中的一部分二級碎片離子的響應(yīng)值越來越高，逐漸從該化合物的全部二級碎片離子中突顯出來。181.064 6和207.044 3 2個二級碎片離子的響應(yīng)值較高。因此，對于青藤堿，宜以181.064 6和207.044 3 作為該化合物的定性離子對。由圖 3還發(fā)現(xiàn)，對于 181.064 6在碰撞能量為 30 eV 的條件下，響應(yīng)值最高，對于207.044 3在碰撞能量為35 eV時，響應(yīng)值最高。

同理根據(jù) 5 種非法添加物的二級質(zhì)譜圖，對5種非法添加物的定性離子對及最優(yōu)碰撞能量進(jìn)行了統(tǒng)計，見表4。

由表 4 可以看出，5 種非法添加物的一、二級質(zhì)譜離子的質(zhì)量數(shù)都精確到了小數(shù)點后4位，具有超高精確度和準(zhǔn)確度，且 5 種非法添加物的保留時間為 2.0～3.2 min，分析速度快。

2.1.3 建立5種非法添加物檢測的方法參數(shù) 通過所確立最佳的試驗條件設(shè)置的各試驗參數(shù)，建立了安神類保健品5 種非法添加物的數(shù)據(jù)庫。優(yōu)化后的方法參數(shù)如表 5 所示。

2.2 定量方法學(xué)考察

2.2.1 檢出限和定量限測定 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液，用甲醇稀釋成一定質(zhì)量濃度的溶液后測定各化合物的信噪比，依據(jù)檢出限為3倍信噪比(S/N=3)，定量限為10倍信噪比(S/N=3)，結(jié)果如表6所示。

由表6可以看出，5 種非法添加物的檢出限≤0.9 μg/L，定量限都≤3 μg/L，說明所建立的試驗方法靈敏度高、準(zhǔn)確度強。

表4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化結(jié)果

表5 方法參數(shù)一覽表

表6 5種化合物的檢出限和定量限

2.2.2 線性關(guān)系考察 分別精密取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋成10，100，500，800，1 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液，用液相色譜—串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜的試驗方法進(jìn)行測定。以化合物一級精密質(zhì)量數(shù)的峰面積(Y)對相應(yīng)質(zhì)量濃度(X)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，線性關(guān)系如表7所示。

由圖4和表7可知，5種化合物在10～1 000 μg /L時線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)>0.99。進(jìn)一步的證明本試驗所建立的方法精密度高、靈敏度強。

2.2.3 回收率與精密度 分別取空白的陰性樣品1.0 g于50 mL離心管中，并在每支試管中分別加入適量的羅通定、青藤堿、文拉法辛、褪黑素、扎來普隆，用甲醇稀釋至10 mL，以配制成含有這 5種非法添加物的10.0，50.0，100.0 μg/L 3個濃度的加標(biāo)溶液，每個濃度需添加6次，超聲20 min，靜置10 min后，取其上清液過0.22 μm微孔濾膜，然后進(jìn)行分析。根據(jù)外標(biāo)法計算這5種非法添加物的回收率，并計算該方法的精確度，如表8所示。

圖4 5 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

化合物線性回歸方程R2青藤堿 y=33.594x-24.5610.998 7羅通定 y=28.334x+27.2140.997 3文拉法辛y=1.583 7x+52.2350.995 9褪黑素 y=13.583x-299.870.994 7扎來普隆y=7.943 6x-473.190.990 2

表8 5種化合物的回收率與精密度

由表8可以看出，空白樣品中的平均回收率為92.8%～110.1%，精密度為0.9%～1.8%。更加進(jìn)一步地證明本試驗所建立的方法靈敏度高、選擇性強。

2.3 樣品測定

采用本研究的方法對市售的6種安神類保健品進(jìn)行檢測，只有膠囊D檢出了青藤堿，經(jīng)定量分析測得青藤堿含量為1.656 mg/kg，其他5種樣品均未檢出5種藥物。

對膠囊D的一級質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，可以提取出質(zhì)荷比(m/z)為330.168 8 的化合物，且該化合物的保留時間為 2.176 min(圖5)，與青藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的一級質(zhì)譜圖吻合，可以基本確定膠囊D中添加了青藤堿。

圖5 膠囊D的青藤堿質(zhì)譜圖

為了進(jìn)一步確證該樣品中含有非法添加物青藤堿，對樣品的二級質(zhì)譜圖進(jìn)行分析見圖6。由圖6可知，響應(yīng)強度較高的2個碎片離子分別為 181.069 7和207.044 3，與青藤堿的定性離子對181.064 5和207.043 8 吻合，且質(zhì)荷比在偏差范圍內(nèi)，因此，可以確定膠囊D中330.168 8 的色譜峰為青藤堿。

圖6 膠囊D的二級質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本試驗建立了一種同時檢測安神類保健食品中青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素5種非法添加物的方法。該法分析速度快、靈敏度高、選擇性強、精密度高，定性和定量一次完成，回收率和精密度均能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，可用于保健品中安神類非法添加物的檢測。但本試驗僅研究了5種化合物，后續(xù)宜擴(kuò)大這類非法添加物的種類，使中國保健品食品檢測技術(shù)更加成熟，適用性更廣。