復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑抗炎鎮(zhèn)痛作用研究

* 曉輝

1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832000;2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123

復(fù)方鵝絨藤藥方來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，由戟葉鵝絨藤、白花菜子等6味藥材組成，主要用于肩周炎和腰肌勞損等多種外周關(guān)節(jié)炎性疼痛的治療。戟葉鵝絨藤[1](Cynanchumsibiricumwilld)為蘿藦科鵝絨藤屬的植物，是新疆特產(chǎn)藥材，多生于干旱及荒漠灰鈣土洼地，苦，涼，入心經(jīng)，具有化濕利水，祛風(fēng)止痛的作用。白花菜子[2-3]為河北省習(xí)用藥材，性味苦、辛，溫，具有祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效，常用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷及股骨頭壞死等病癥。此外，戟葉鵝絨藤具有生命力強(qiáng)、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，是一種具有很高開(kāi)發(fā)前景的新型藥用植物。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠熱板法、冰醋酸扭體法、二甲苯小鼠耳腫脹以及慢性肉芽腫四種動(dòng)物模型探討復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑外用給藥的鎮(zhèn)痛抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 儀器 前列腺素E2(PGE2)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)；電子天平SE602F(奧豪斯儀器上海有限公司)；ZH-YLS-68智能熱板儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI Rotaucpor R-200.BUCHI Heating Bath B-490)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥物 戟葉鵝絨藤采于新疆石河子市，經(jīng)石河子大學(xué)中藥學(xué)專(zhuān)家陳虹教授鑒定為蘿藦科鵝絨藤屬植物戟葉鵝絨藤；消炎鎮(zhèn)痛膏(云南白藥集團(tuán)股份有限公司)；0.9%生理鹽水注射液(新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司)；75%乙醇(天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司)；蒸餾水；0.6%醋酸。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄兼用，體重(20±2)g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)SCXK(新)2011-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境:溫度(20～22℃),相對(duì)濕度(60～65)%,人工光照, 12 h明暗周期。

1.4 方法

1.4.1 有效部位提取及凝膠膏劑制備 分別稱(chēng)取復(fù)方鵝絨藤處方中6味藥材3 kg，適度粉碎，置于大燒杯中，加濃度為75%的乙醇攪拌浸泡12 h，浸泡后置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，用10倍量濃度為75%的乙醇攪拌并加熱回流提取3次，每次2 h，取濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，65℃以下減壓濃縮至黑褐色浸膏，出膏率為17.8%，進(jìn)一步濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.24(60℃)。

在提取出的復(fù)方鵝絨藤浸膏中按比例分別加入NP-700、卡波姆、甘羥鋁、酒石酸、甘油、氮酮、丙二醇涂布，放置成型，制得藥物凝膠膏劑。以小鼠腹部皮膚為滲透介質(zhì)，20%乙醇-生理鹽水為接收液，用改良Franz擴(kuò)散池裝置測(cè)得所制藥物貼膏中總黃酮24 h累積滲透率為28.181%。

1.4.2 復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑對(duì)醋酸所致小鼠扭體的影響 選取小鼠60只，雌雄兼用，體重在(20±2)g，用電動(dòng)剃毛器除去腹部被毛，隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。模型組小鼠腹部粘貼不含藥物的空白貼膏，陽(yáng)性組粘貼消炎鎮(zhèn)痛膏，低、中、高劑量組分別粘貼的復(fù)方鵝絨藤凝膠貼膏規(guī)格分別為13 mg生藥/cm2、26 mg生藥/cm2、52 mg生藥/cm2，各組貼片均為圓形，直徑2 cm。實(shí)驗(yàn)前用酒精棉擦拭小鼠腹部皮膚，之后各組貼膏粘貼于小鼠腹部皮膚，持續(xù)24 h，其間小鼠束足，24 h后除去貼片，解放小鼠束足，使小鼠充分活動(dòng)30 min后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL，之后立即記錄15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，計(jì)算藥物的鎮(zhèn)痛百分率：

鎮(zhèn)痛百分率(%)=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%.

1.4.3 對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)的影響 雄性小鼠因受熱陰囊觸及熱板，可出現(xiàn)假性結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用雌性小鼠(20±2)g。于實(shí)驗(yàn)前在(55±0.5)℃的恒溫水浴中放入玻璃燒杯，將小鼠放于其中，以小鼠舔后足為疼痛反應(yīng)指標(biāo)，測(cè)定每只小鼠的初始痛閾值。痛閾值在5～30 s內(nèi)為合格動(dòng)物(即對(duì)熱敏感)。將痛閾合格的60只雌性小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只，進(jìn)行足部貼敷給藥，貼片直徑1 cm，給藥方法參照“1.2.2”，在 0.5 h、1 h、2 h、4 h按上述基礎(chǔ)痛閾值測(cè)定法分別測(cè)定各小鼠的痛閾值。超過(guò)40 s不舔足者按40 s計(jì)。記錄小鼠給藥前后痛閾值(s)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.4 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 篩選體重(20±2)g合格小鼠60只，雌雄兼用，貼片直徑8 mm，分組及給藥方法同“1.2.2”，每組12只。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h，右耳貼敷給藥，結(jié)束給藥30 min后，于小鼠右耳前后兩面用20 μL二甲苯均勻涂抹，左耳不做任何處理，作為對(duì)照，2 h后將小鼠處死，分別在左、右耳同一部位用打孔器打下直徑為8 mm小鼠耳片，分別稱(chēng)重，計(jì)算左、右耳片重量之差，用來(lái)評(píng)價(jià)炎癥腫脹程度，分別計(jì)算并記錄各給藥組的耳腫脹抑制率和腫脹率。計(jì)算方式如下：

腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100% ；腫脹率(%)=[右耳片重(g)-左耳片重(g)]/左耳片重(g)×100%。

1.4.5 慢性肉芽腫實(shí)驗(yàn) 篩選體重(20±2)g小鼠60只，雌雄兼用，麻醉后，于后肢一側(cè)腹股溝處切口，皮下植入已知重量的滅菌棉球，切口縫合，術(shù)后2 h開(kāi)始給藥，貼片直徑1.5 cm，分組及給藥方法同“1.2.2”，每天更換新貼膏，連續(xù)給藥5 d，于第6d處死，取出棉球，在烘箱干燥后，精確稱(chēng)重，與原棉球重量之差即為肉芽腫凈重，比較各組肉芽腫凈重。計(jì)算方式如下：

肉芽腫凈重=術(shù)后棉球凈重(g)-術(shù)前棉球凈重(g);

小鼠肉芽腫脹抑制率(%)=(模型組肉芽腫平均質(zhì)量-給藥組肉芽腫平均質(zhì)量)/模型組肉芽腫平均質(zhì)量×100%。

1.4.6 炎癥組織中PGE2含量的測(cè)定 取體重(20±2)g小鼠60只，雌雄兼用，分組及給藥方法同“1.2.3”，連續(xù)給藥5 d，末次給藥后30 min，對(duì)每只小鼠右足皮下進(jìn)針于踝關(guān)節(jié)處注射0.1%角叉菜膠生理鹽水溶液 0.1 mL ，注射后 8 h時(shí)，于踝關(guān)節(jié)下將致炎足全部剪下，稱(chēng)重，剝皮剪碎，生理鹽水漂洗2 min，以濾紙吸干水分，加入適量生理鹽水進(jìn)行研磨，制備成勻漿液，以2500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心30 min，收集上清液保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí)，嚴(yán)格按照PGE2酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作，測(cè)定炎性組織中PGE2含量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)0.6%醋酸所致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)的影響 由表1可知，與模型組比較，消炎鎮(zhèn)痛膏組、給藥組低、中、高劑量均可明顯降低醋酸致小鼠扭體次數(shù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響

2.2 對(duì)小鼠熱板致痛的影響 由表2可知，與給藥前痛閾值相比，消炎鎮(zhèn)痛膏組能顯著性提高小鼠的痛閾值(P<0.05)；復(fù)方鵝絨藤給藥組低、中、高劑量無(wú)顯著性差異；隨給藥劑量增加，給藥組小鼠舔足反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間無(wú)明顯提高。

表2 復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑對(duì)熱板法致痛小鼠的影響

2.3 復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 由表3可知，與模型組比較，消炎鎮(zhèn)痛膏組以及給藥組低、中、高劑量均能顯著性降低二甲苯所致小鼠耳腫脹度(P<0.05)。且隨藥物劑量增加，腫脹抑制率增加。

表3 復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

2.4 對(duì)慢性肉芽腫的影響 由表4可知，與模型組比較，消炎鎮(zhèn)痛膏組以及復(fù)方鵝絨藤中、高劑量組均能顯著性抑制小鼠的肉芽腫生成(P<0. 05)；隨給藥劑量增加，腫脹抑制率增加。

表4 復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑對(duì)小鼠慢性肉芽腫的影響

2.5 對(duì)炎癥組織中PGE2含量的影響 由表5可知，與模型組比較，復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑低劑量組在抑制炎癥部位PGE2生成方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組與模型組比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)，說(shuō)明復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑能夠顯著抑制炎癥部位PGE2生成。

表5 復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑對(duì)炎癥組織中PGE2含量的影響

3 討 論

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)局部損傷的反應(yīng)。前列腺素(PG)是花生四烯酸在環(huán)氧化酶作用下的代謝產(chǎn)物，PGE2是其中一個(gè)重要的炎癥介質(zhì)，其可以擴(kuò)張血管、協(xié)同趨化因子的激活并通過(guò)增強(qiáng)血管壁通透性、大量吸引中性粒細(xì)胞從而引起發(fā)熱，并導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏從而引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展[4]。除此之外，炎癥發(fā)生時(shí)，大量氧自由基會(huì)伴隨PGE2的產(chǎn)生而產(chǎn)生，氧自由基通過(guò)誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用而引起細(xì)胞損傷。

復(fù)方鵝絨藤來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，已于臨床應(yīng)用20多年，多以戟葉鵝絨藤等6味藥材混合研磨后制成普通膏劑，貼敷局部疼痛部位，以緩解如肩周炎和腰肌勞損等多種外周關(guān)節(jié)炎性病癥，療效受到肯定。但由于傳統(tǒng)貼膏釋藥性能較差，載藥不均勻，膏體易污染衣物等諸多缺點(diǎn)，使臨床用藥受到影響[5]。針對(duì)傳統(tǒng)貼膏的不足，本課題前期已將其改造成現(xiàn)代凝膠膏劑，工藝可行、可靠。本實(shí)驗(yàn)采用四種經(jīng)典動(dòng)物模型對(duì)復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑是否仍具有抗炎鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)中復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑對(duì)三種模型(小鼠扭體、二甲苯致小鼠耳腫脹及慢性肉芽腫)均表現(xiàn)出良好的藥用效果；而熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果不顯著，原因可能是兩種致痛模型反映不同的作用機(jī)理，前者所模擬的為周?chē)窠?jīng)參與的炎癥性疼痛，而后者模擬的為高位中樞神經(jīng)參與的疼痛，說(shuō)明復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑作為外用藥對(duì)中樞神經(jīng)的抑制作用較弱，而對(duì)周?chē)窠?jīng)參與的局部炎性疼痛有很好的抑制作用。通過(guò)對(duì)炎性足部中PGE2含量的測(cè)定，認(rèn)為復(fù)方鵝絨藤凝膠膏劑的抗炎鎮(zhèn)痛與抑制炎癥部位PGE2的產(chǎn)生和釋放有關(guān)，但具體抗炎機(jī)制有待進(jìn)一步研究。