石榴3—脫氫奎尼酸合成酶基因的克隆及表達(dá)分析

尹燕雷　陶吉寒　楊雪梅

摘要：利用RT-PCR技術(shù)從泰山紅石榴（Punica granatum L.）果皮中獲得3-脫氫奎尼酸合成酶（DHQS）基因cDNA序列，分析了其在不同石榴品種發(fā)育期果實(shí)中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，DHQS基因cDNA序列長(zhǎng)273 bp，編碼91個(gè)氨基酸，編碼蛋白具有典型的DHQ_Fe_ADH超家族保守結(jié)構(gòu)域。該基因核苷酸序列與歐洲山毛櫸、梅花和蒺藜苜蓿的相似性分別為91%、87%和88%，氨基酸序列與歐洲山毛櫸、蘋果、白梨和擬南芥的相似性分別為95%、92%、92%和88%。兩個(gè)石榴品種發(fā)育期果皮中DHQS基因相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，均在7月15日出現(xiàn)峰值。整個(gè)發(fā)育期，泰山紅DHQS基因表達(dá)量高于泰山三白甜。

關(guān)鍵詞：石榴（Punica granatum L.）；3-脫氫奎尼酸合成酶；克??；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S665.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）18-0103-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.026 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Cloning and Expression Analysis of 3-dehydroquinate Synthase Gene in Pomegranate

YIN Yan-lei，TAO Ji-han，YANG Xue-mei，TANG Hai-xia，F(xiàn)ENG Li-juan

（Shandong Institute of Pomology，Tai'an 271000，Shandong，China）

Abstract： The 3-dehydroquinate synthase（DHQS） cDNA sequence was cloned from Taishanhong pomegranate（Punica granatum L.） pericarp with RT-PCR technique. The expression of DHQS gene was analyzed in different pomegranate cultivars fruits during development. The result showed that the cDNA sequence length of DHQS was 273 bp，which encoded 91 amino acids. The protein of DHQS gene contained DHQ_Fe_ADH superfamily conservative structure domain. The similarity of DHQS nucleotide sequence in pomegranate and Fagus sylvatica，Prunus mume，Medicago truncatula were 91%，87% and 88%，respectively. The similarity of DHQS deduced amino acid sequences in pomegranate and Fagus sylvatica，Malus domestica，Pyrus x bretschneideri，Arabidopsis thaliana were 95%，92%，92% and 88%，respectively. The relative expression level of DHQS gene decreased gradually with the fruit development in two pomegranate cultivars，which peak value appeared at July 15th. The relative expression level of DHQS gene in Taishanhong was higher than that in Taishansanbaitian in the whole development period.

Key words： Punica granatum L.； 3-dehydroquinate synthase； cloning； expression analysis

石榴（Punica granatum L.）種質(zhì)資源豐富，適應(yīng)性強(qiáng)，在熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區(qū)都有栽培[1，2]。沒(méi)食子酸、咖啡酸和綠原酸等是石榴中含量較為豐富的酚酸類物質(zhì)，具有諸多保健功能，逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)。

莽草酸途徑與沒(méi)食子酸、咖啡酸和綠原酸的生物合成密切相關(guān)[3，4]。3-脫氫奎尼酸合成酶（3-dehydroquinate synthase，DHQS）是莽草酸途徑中的第2個(gè)關(guān)鍵酶，能催化3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，DAHP）生成3-脫氫奎尼酸（Dehydroquinate，DHQ）[5]。DHQ既參與合成沒(méi)食子酸的前體物質(zhì)3-脫氫莽草酸，又參與合成綠原酸的前提物質(zhì)奎尼酸和咖啡酸[6，7]。對(duì)DHQS基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析為從分子水平揭示植物中酚酸類物質(zhì)代謝機(jī)理提供了理論依據(jù)。

目前，DHQS活性測(cè)定、基因克隆表達(dá)方面的研究在原核生物和真核生物中[8-10]研究較多，植物中DHQS生化特性、分子結(jié)構(gòu)及基因克隆表達(dá)的研究?jī)H在獼猴桃[5]、狹葉松果菊[7]、歐洲山毛櫸[11]和柿子[12]中有少量報(bào)道，蘋果、梨等果樹上DHQS基因序列主要通過(guò)全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)得到，石榴中DHQS基因克隆及表達(dá)方面的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆泰山紅石榴果皮DHQS基因cDNA序列，對(duì)其在不同品種中的表達(dá)情況進(jìn)行熒光定量PCR分析，為揭示石榴果實(shí)中酚酸類物質(zhì)代謝的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種均采自山東省果樹研究所石榴種質(zhì)資源圃。基因克隆以泰山紅幼果期果實(shí)（直徑2～3 cm）為試材，果皮用液氮冷凍后儲(chǔ)存于-80 ℃中備用。

熒光定量表達(dá)分析以泰山紅和泰山三白甜不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)為試材。2016年7月15日開始采樣，每隔10 d采1次，直至10月2日成熟時(shí)為止。每品種選長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯樹10株，每次采均勻、無(wú)病蟲害的果實(shí)10個(gè)，采后低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，果皮液氮冷凍后，于-80 ℃保存。

1.2 保守片段的克隆

利用RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取果皮總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，Nanodrop 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量。按照Thermo Scientific Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622說(shuō)明書合成cDNA 第一鏈。

根據(jù)已知DHQS基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物DHQS1：5′-RARRCATGTYCAYGGDAAGA-3′和DHQS2：5′-MCATHACVGTNGTDGGRATCTG-3′。PCR反應(yīng)體系為2×Ex Taq Buffer 25 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 5 μL，Ex Taq酶1.0 μL，去離子水15 μL，總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的片段克隆至pMD18-T Vector送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，獲得中間片段序列[13]。

1.3 序列分析

利用ORF Finder預(yù)測(cè)序列的開放閱讀框；利用DNAMAN分析序列編碼的蛋白質(zhì)序列；利用NCBI的BLASTn和BLASTp分析拼接序列核苷酸和氨基酸序列的相似性；用CDD 進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.4 熒光定量PCR分析

使用天根RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取不同時(shí)期石榴果皮總RNA，利用寶生物工程（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。

分別以兩個(gè)品種不同時(shí)期果皮cDNA為模板，根據(jù)獲得DHQS基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 特異引物DHQS3：5′-TTAACTAAGGGAAACCCAA ATGTC-3′和DHQS4：5′-AAAGAGGCAGCAGCAAA ACC-3′。熒光定量PCR反應(yīng)體系按SYBR？誖 Green PCR Master Mix說(shuō)明書配制，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為SYBR Green Master Ⅰ 10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；最后退火至55 ℃，每隔7 s上升0.5 ℃至95 ℃，共81個(gè)循環(huán)。以石榴Actin（GU376750.1）為內(nèi)參基因，每個(gè)基因擴(kuò)增均有內(nèi)參基因同時(shí)擴(kuò)增，默認(rèn)條件下讀取Ct 值，采用2-ΔΔCT方法，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴DHQS基因保守序列的克隆

以石榴果皮cDNA為模板，利用簡(jiǎn)并引物DHQS1和DHQS2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到一條長(zhǎng)273 bp的目的片段（圖1）。經(jīng)測(cè)序和比對(duì)確定其是DHQS基因片段，該基因片段共編碼91個(gè)氨基酸（圖2）。

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，將DHQS基因片段的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，其與歐洲山毛櫸（Fagus sylvatica，Accession：DQ166522.1）、梅花（Prunus mume，Accession：XM_008243830.1）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，Accession：XM_003612164.1）的相似性分別為91%、87%和88%。將其氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與歐洲山毛櫸（Accession：ABA54866.1）、蘋果（Malus domestica，Accession：XP_008352428.1）、白梨（Pyrus x bretschneideri，Accession：XP_009363469.1）和擬南芥（Arabidopsis thaliana，Accession：NP_8512

79.1）等的相似性分別為95%、92%、92%和88%。由此確認(rèn)克隆到的片段為石榴果皮DHQS基因，GenBank登錄號(hào)為KY200850。

2.2 保守結(jié)構(gòu)域分析

CDD分析表明，石榴DHQS蛋白具有典型的DHQ_Fe_ADH超家族保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。

2.3 不同石榴品種DHQS基因表達(dá)分析

兩個(gè)石榴品種果皮中DHQS基因隨發(fā)育時(shí)間的增加也呈逐漸降低的變化趨勢(shì)，均在7月15日出現(xiàn)峰值（圖4）。整個(gè)發(fā)育期，泰山紅DHQS基因表達(dá)量高于泰山三白甜。在7月15日，泰山三白甜果皮中DHQS基因相對(duì)表達(dá)量與其他時(shí)期差異極顯著（P<0.01）。

3 小結(jié)與討論

本研究利用RT-PCR技術(shù)從石榴果皮中克隆得到DHQS基因保守片段，具有典型的DHQS基因特征結(jié)構(gòu)域，這與茶樹上[3]的研究結(jié)果一致。由于石榴果皮富含多糖多酚物質(zhì)，提取RNA的純度不能滿足DHQS基因3′端和5′端序列克隆的需要，后續(xù)將改進(jìn)試驗(yàn)方案，克隆得到DHQS基因全長(zhǎng)cDNA序列。

不同石榴品種發(fā)育期果皮中DHQS基因的表達(dá)量逐漸降低，這與臭氧處理煙草中DHQS基因的表達(dá)趨勢(shì)[14]基本一致。研究表明，臭氧處理?xiàng)l件下，歐洲山毛櫸葉片中DHQS基因上調(diào)表達(dá)[11]，這種差異性可能與物種自身的特性有關(guān)。DHQS基因在狹葉松果菊花和葉中表達(dá)量較高[7]，在第三片茶葉中表達(dá)量最高，在頂芽表達(dá)量最低[3]。本研究分析了不同品種果皮中DHQS基因的表達(dá)情況，不同部位中DHQS基因的表達(dá)水平還需深入研究。

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