煙草黑脛病拮抗芽孢桿菌的篩選及生防效果評價

施河麗　譚軍　丁才夫

摘要：為了防治煙草疫霉對煙草引起的病害，從不同煙田健康煙株根際土壤中篩選分離42株根際細菌，經(jīng)平板對峙初篩、細菌發(fā)酵液115 ℃處理后復篩得到10株對煙草黑脛病病原菌（Phytophthora parasitica）具有較好抑制效果的芽孢桿菌。經(jīng)分子生物學鑒定可將其分為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）3類。選取枯草芽孢桿菌GJ1、解淀粉芽孢桿菌GJ7和貝萊斯芽孢桿菌GJ11對各類芽孢桿菌進行纖維素酶和蛋白酶分泌特性檢測、煙草根際土壤、根和莖定殖能力檢測以及田間試驗，得出這3種芽孢桿菌均可分泌纖維素酶和蛋白酶，均能在煙草根際土壤、根和莖中定殖，在根際土壤中定殖能力為GJ1>GJ7>GJ11，在根和莖中定殖能力均為GJ7>GJ1>GJ11。GJ1、GJ7、GJ11對煙草黑脛病田間相對防治效果分別為33.33%、80.00%、28.60%，初步確定拮抗芽孢桿菌田間防治效果取決于其在煙草內(nèi)定殖能力。

關鍵詞：煙草黑脛病病原菌（Phytophthora parasitica）；拮抗細菌；定殖能力；防治效果

中圖分類號：S476；S435.72 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）18-0060-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.014 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Selecting of Antagonistic Bacillus against Tobacco Black Shank and Detecting of Control Efficacy

SHI He-li，TAN Jun，DING Cai-fu，ZHAO Xiu-yun，XIANG Bi-kun，LUO Fang

（Enshi Tobacco Company of Hubei Province，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： In order to control the tobacco black shank caused by Phytophthora parasitica var. nicotianae，42 bacterial strains were isolated from different health status tobacco rhizosphere soil，10 of them had an antagonistic effect on P. nicotianae by using the plate confronting method and treatment with fermentation filtrate after heated at 115 ℃. Three groups of Bacillus could be identified under the 16S rDNA sequence analysis：Bacillus amyloliquefaciens， B. subtilis and B. velezensis. The characteristics of cellulase and protease activity，colonization of Bacillus in tobacco rhizosphere soil，root and stem，and field experiments were carried out on B. subtilis GJ1，B. amyloliquefaciens GJ7 and B. velezensis GJ11. The results showed that GJ1，GJ7 and GJ11 strains could secrete cellulase and protease，and colonize in the rhizosphere soil，root and stem of tobacco. The ability of colonization in the rhizosphere soil was GJ1>GJ7>GJ11，in root and stem was GJ7>GJ1>GJ11. However，the control efficiency against tobacco black shank of GJ1，GJ7 and GJ11 were 33.33%，80.00% and 28.60%，respectively，suggesting that the control efficacy in field of antagonistic Bacillus may depend on its colonization ability in tobacco.

Key words： Phytophthora parasitica； antagonistic bacteria； colonization； control efficacy

煙草黑脛病是一種嚴重影響煙草生長的土傳真菌病害，由煙草黑脛病病原菌疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起。主要發(fā)病期在煙草的成株期，病原侵染莖基部，以根莖部發(fā)病為主，向髓部擴展，病株葉片自下而上依次變黃，直至整株煙草枯死，給煙草種植帶來巨大的經(jīng)濟損失[1]。近年來有關防治措施主要有化學防治、輪作、抗病品種選育等，但這些措施都存在缺陷。長期使用化學藥劑可導致病原菌耐藥性增強、煙葉農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境[2]，使用抗病品種會使煙葉質(zhì)量下降，給卷煙的安全性和煙葉出口帶來嚴重的不利影響[3]。生物防治具有無污染、無毒害、無殘留、可持續(xù)、環(huán)境友好等特點，其已受到煙草病害防治的重視。

土壤中微生物種類豐富，植物根際土壤中含有促進植物生長、對植物病原菌有拮抗作用的微生物[4]。已有報道指出，從煙草根際土壤分離出對煙草黑脛病病原菌具有良好防治效果的芽孢桿菌[5]和有益真菌[6]，這些有益菌株主要通過競爭作用、抑制作用、寄生作用和誘導植物抗病性來抑制病原菌對植物的侵染[7]。因此，根據(jù)生態(tài)平衡原則分離具有拮抗功能的有益微生物是一種充分利用土壤微生物的有效策略。

本研究通過從不同煙田健康煙株根際土壤篩選拮抗煙草黑脛病病原菌的細菌，得到10株抑菌效果較好的芽孢桿菌；通過16S rDNA序列分析進行分類鑒定；同時檢測菌株的纖維素酶和蛋白酶活性，以及其在煙草根際土壤、根和莖中定殖能力及田間防治效果，可為微生物農(nóng)藥等生物防治技術提供菌種資源，為煙草黑脛病的生物防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌菌種：黑脛1號菌種，實驗室保藏。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，無菌水1 000 mL，自然pH。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，無菌水1 000 mL，pH 7.0。

酪蛋白培養(yǎng)基：KH2PO4 0.36 g，Na2HPO4·12H2O 1.2 g，NaCl 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，CaCl2·2H2O 0.002 g，酪素4 g，無菌水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，NaNO3 3 g，KCl 0.5 g，羧甲基纖維素納10 g，瓊脂20 g，無菌水1 000 mL，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：小麥粉50 g，蛭石50 g，2%紅糖水60 mL。

土壤樣品：云煙87健康煙田煙株根際土壤、云煙87黑脛病發(fā)病嚴重煙田健康煙株根際土壤。

1.2 細菌的分離

準確稱取10 g土壤樣品加入裝有90 mL無菌水并放有小玻璃珠的250 mL錐形瓶中，置于搖床振蕩30 min，靜置待土樣沉降至瓶底，將所得土壤浸液按照梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6稀釋液0.1 mL于LB培養(yǎng)基平板上，并用無菌涂布器涂布均勻，37 ℃培養(yǎng)1～2 d；挑取形態(tài)差異明顯的菌落進行劃線分離純化培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)后，4 ℃冰箱保存。

1.3 拮抗細菌的篩選

初篩：將煙草黑脛病病原菌保藏菌種進行活化培養(yǎng)7 d，用打孔器在菌落邊緣區(qū)域打孔制成菌餅（直徑5 mm），轉(zhuǎn)接在PDA平板中央28 ℃培養(yǎng)48 h后，將分離到的細菌菌株點接在距煙草黑脛病病原菌菌片25 mm處，每皿接種4個菌株，同時設空白對照（不接菌），重復3次，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察抑菌效果。選擇抑菌效果顯著的菌落進行純化，并保存。

復篩：通過測定各細菌的抑菌圈寬度，選取抑菌圈寬度大于16 mm的細菌進行抗菌活性測定。其中細菌發(fā)酵培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為豆粕粉12 g/L、玉米淀粉15 g/L、NH4NO3 2 g/L、NaHPO4 2 g/L，pH 7.5。裝液量為60%，以菌齡為18 h細菌按接種量5%接種，28 ℃培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵后的培養(yǎng)液8 000 r/min離心5 min，取上清液于115 ℃滅菌10 min，按照處理后的發(fā)酵液與培養(yǎng)基體積比為1∶9混合后倒入平板，冷卻后接入5 mm煙草黑脛病病原菌菌餅，同時以無菌水為對照，從2 d時開始到黑脛病病原菌長滿整個平板，測定抑菌圈。

1.4 16S rDNA序列鑒定拮抗細菌

采用CTAB法提取拮抗細菌基因組NDA[8]。16S rDNA擴增引物和反應條件參考王亞會等[9]方法。將16S rDNA擴增產(chǎn)物純化回收后測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，通過MEGA 4.0軟件對拮抗細菌進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

1.5 拮抗細菌定殖能力檢測

1.5.1 細菌利福平抗性誘導 首先在LB培養(yǎng)基上劃線活化拮抗細菌，挑取單菌落轉(zhuǎn)入含1 μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，然后在含1 μg/mL利福平的LB平板上劃線培養(yǎng)，待單菌落長出后挑取其轉(zhuǎn)入下一個梯度中，依次經(jīng)過含利福平2、5、10、20、40、60 μg/mL的LB培養(yǎng)基誘導，直至最后篩選到穩(wěn)定的抗利福平60 μg/mL的突變菌株。

1.5.2 灌根 將成功誘導的菌株用接種環(huán)挑取1～2環(huán)于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，平板計數(shù)各菌種活菌數(shù)。各菌種取50 mL培養(yǎng)液對煙草進行灌根處理，每種菌灌根6株煙草。灌根后7、14、21、28、45 d檢測煙草根際土壤、根和莖菌體濃度。

1.5.3 內(nèi)生細菌分離 將灌根處理的煙草連根際土壤一起取出，抖落根際土壤并標記；洗凈多余的根際土壤，將根和莖沖洗干凈，進行根、莖分離；將根和莖先用75%乙醇消毒10 s，后用0.1%升汞消毒30 s，無菌水沖洗3次；消毒后的組織放入研缽，加入無菌水（并記下無菌水體積）磨成漿狀物，并稀釋成不同濃度，靜置3 min，取100 μL汁液涂于含60 μg/mL利福平的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察統(tǒng)計各濃度下菌落數(shù)并計算各組織菌體含量。

組織中含菌量=[（菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×分離用水毫升數(shù)）÷（涂板水毫升數(shù)×分離組織克數(shù)）]；

每克根際土壤含菌量=同一稀釋濃度幾次重復的菌落平均數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。

1.6 拮抗微生物分泌纖維素酶能力測定

將純化后的拮抗細菌，用無菌牙簽挑取點接在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，向平板中加入1 mg/mL剛果紅染液（以覆蓋整個平板為益），10～15 min后，倒去剛果紅染液，加入1 mol/L NaCl溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，反復操作3～4次，觀察是否出現(xiàn)水解圈。

1.7 拮抗微生物分泌蛋白酶能力測定

將純化后的拮抗細菌，用無菌牙簽挑取點接在酪蛋白培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d觀察是否出現(xiàn)水解圈。

1.8 田間試驗

1）地理環(huán)境。田間試驗在襄陽市南漳縣薛坪鎮(zhèn)栗林坪村進行，該地土壤為黃棕壤，質(zhì)地疏松，肥力中等，通透性好。

2）試驗藥劑。將拮抗細菌在含利福平濃度為30 μg/mL的LB培養(yǎng)液中于37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)12～16 h，按2%接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)7 d后自然干燥用于田間試驗。

3）處理與藥劑用量。設置4個處理，分別為枯草芽孢桿菌GJ1、解淀粉芽孢桿菌GJ7、貝萊斯芽孢桿菌GJ11、霜霉威鹽酸鹽。施用方法：拮抗細菌固體發(fā)酵菌粉各200 g，霜霉威鹽酸鹽（有效含量66.5%）80 mL加至50 L水中，每株煙草灌根200 mL。共施用2次，移栽后15、30 d各施用1次。每個處理分為兩行，每行64株煙草。

4）調(diào)查、記錄和測定方法。①調(diào)查時間和次數(shù)。共調(diào)查2次，移栽當天調(diào)查1次（病情基數(shù)），此后每隔15 d調(diào)查1次。②調(diào)查方法。以株為單位，調(diào)查發(fā)病分級標準，按國家煙草病害調(diào)查分級標準GB/T23222-2008[10]進行。③藥效計算方法。病情指數(shù)=[Σ（各級病株×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）]×100。防治效果（相對防效）=[（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌的初篩

從健康煙田煙株根際土壤中共分離純化獲得細菌31株，其中通過平板對峙初篩得出對煙草黑脛病病原菌有抑制作用的細菌有8株，拮抗菌分離率為25.81%；從發(fā)病嚴重煙田健康煙株根際土壤中共分離純化獲得細菌11株，其中通過平板對峙初篩得出對煙草黑脛病病原菌有抑制作用的細菌有7株，拮抗菌分離率為63.64%。圖1顯示兩種土壤中對煙草黑脛病病原菌有拮抗作用的部分細菌。

2.2 拮抗細菌的復篩

如表1所示，比較細菌發(fā)酵液高溫處理后對煙草黑脛病病原菌的抑菌活性，進行復篩，得出高溫處理后的細菌發(fā)酵液處理煙草黑脛病病原菌48 h后，抑菌率大于40%的細菌有10株，且各細菌對煙草黑脛病病原菌的抑菌率隨時間延長而減小。對照組菌絲向外延伸，而處理組的菌絲則向中心聚攏，菌落生長明顯被抑制（圖2）。表明各細菌可產(chǎn)生耐高溫的抗菌活性物質(zhì)。其中，抗菌活性最高的菌株為GJ11，48 h的抑菌率為73.24%。

2.3 拮抗細菌16S rDNA序列分析及分子生物學鑒定

提取復篩得到的10株細菌基因組DNA，并以此為模板擴增各細菌16S rDNA，可得出各自大小約為1 200 bp的條帶。經(jīng)測序后，將各自序列在NCBI上用Blast分析，得出10株細菌，可分為3個不同的種。GJ1、GJ6屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），與B. subtilis YB-6（KT377368.1）的相似性為98%。GJ3、GJ7、H11、H12、H13屬于解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），與B. amyloliquefaciens HXD-5（KP900947.1）的相似性為99%。GJ9、GJ10、GJ11屬于貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），與B. velezensis BH21（KT889363.1）的相似性為100%。利用MEGA4.0的Maximum Composite Likelihood模型，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

2.4 纖維素酶和蛋白酶分泌特性檢測

從3種不同種屬芽孢桿菌中選取相應種屬進行纖維素酶分泌能力與蛋白酶分泌能力的檢測。將GJ1、GJ7、GJ11分別接種在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，經(jīng)剛果紅染色處理后可在平板上出現(xiàn)明顯的水解圈（圖4a）。說明3種芽孢桿菌都有分泌胞外纖維素酶的特性。將3種芽孢桿菌接種至酪蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，有明顯的水解圈產(chǎn)生，說明這3種芽孢桿菌也有分泌胞外蛋白酶的特性（圖4b）。GJ11產(chǎn)纖維素酶的能力優(yōu)于GJ1和GJ7，而GJ11產(chǎn)蛋白酶能力與GJ1相當卻優(yōu)于GJ7，說明不同芽孢桿菌之間產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶的能力有差異。

2.5 芽孢桿菌定殖能力檢測

對GJ1、GJ7、GJ11 3種芽孢桿菌進行利福平抗性誘導均可成功實現(xiàn)利福平抗性標記。分別用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)這3種含利福平抗性的拮抗菌株，48 h后調(diào)整發(fā)酵液濃度為108 CFU/mL，采用灌根接種煙草幼苗進行芽孢桿菌定殖能力檢測。結(jié)果如圖5所示，GJ1、GJ7、GJ11菌株在煙草根際土壤、根和莖均可定殖，隨著灌根時間延長在煙草根際土壤中的定殖密度呈下降趨勢，且定殖能力強弱表現(xiàn)為根際土壤>根>莖，說明這3種菌均可從煙草根際土壤進入煙草根中，并逐漸轉(zhuǎn)移至煙草莖中，具有良好的轉(zhuǎn)導能力。在灌根后28 d內(nèi)，GJ1的定殖密度高于GJ7、GJ11，GJ1、GJ7、GJ11的定殖密度，分別是5.61×105、2.30×105、3.90×104 CFU/g，其中GJ1的定殖密度分別是GJ7、GJ11的2.4、14.4倍（圖5a），說明在煙草根際土壤中3種菌的定殖能力強弱表現(xiàn)為GJ1>GJ7>GJ11。

在煙草根中，3種菌的定殖密度可隨時間延長發(fā)生起伏變化，都有先下降后增加的過程，其中GJ7從7 d開始下降，14 d后開始上升，此后定殖密度維持不變，而GJ1和GJ11從14 d開始下降，21 d開始上升，此后定殖密度維持不變，且GJ1與GJ7定殖密度相當，GJ11明顯低于前者（圖5b），說明GJ7對根部環(huán)境適應做出的反應較GJ1和GJ11快，進一步說明GJ7對根部環(huán)境的適應能力優(yōu)于GJ1和GJ11，也說明了在煙草根中3種菌的定殖能力強弱表現(xiàn)為GJ7>GJ1>GJ11。

在煙草莖部，GJ7從7 d開始上升，至14 d達最大定殖密度，為1.7×105 CFU/g，之后一直維持在2.0×104 CFU/g；GJ1從7 d下降，14 d后緩慢上升之后一直下降；GJ11從7 d一直下降，至28 d后緩慢上升，且在45 d時GJ7的定殖密度分別是GJ1、GJ11的11.02、6.96倍，說明在煙草莖中3種菌的定殖能力強弱表現(xiàn)為GJ7>GJ1>GJ11（圖5c）。

2.6 田間試驗

對3種芽孢桿菌進行田間防治效果測定（表2），結(jié)果表明，3種芽孢桿菌對煙草黑脛病均有一定的防治效果，解淀粉芽孢桿菌GJ7相對防效最佳，高達80%，其次為枯草芽孢桿菌GJ1，為33.33%，貝萊斯芽孢桿菌GJ11為28.60%，化學藥劑為28.57%。表明解淀粉芽孢桿菌GJ7防治效果明顯高于化學藥劑，且優(yōu)于枯草芽孢桿菌GJ1和貝萊斯芽孢桿菌GJ11。

3 討論

煙草黑脛病是一種土傳真菌病害，為了找到相應的拮抗微生物有效地對其進行防治，通過在煙草根際篩選有益根際細菌再采用發(fā)酵方式生產(chǎn)生防菌劑施用于根部已成為一種高效可行的生防措施[11]。馮志珍等[11]從陜西省隴縣煙草黑脛病高發(fā)地塊健康煙株根際土中篩選分離得到1株拮抗活性較好的解淀粉芽孢桿菌FB-6，本研究除了從發(fā)病嚴重煙田健康煙株根際土壤篩選拮抗細菌外，同時也在健康煙田煙株根際土壤中分離拮抗細菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)病嚴重煙田健康煙株根際土壤拮抗菌分離率高于健康煙田煙株根際土壤。因此，依據(jù)生態(tài)平衡原理分離拮抗微生物菌株是一種常用策略。

本研究從健康煙田煙株根際土壤與發(fā)病嚴重煙田健康煙株根際土壤共分離出3種不同種屬的芽孢桿菌，但王麗珍等[12]從煙草根際土壤中除分離到具有拮抗作用的芽孢桿菌外，同時還有24株為熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）也具有拮抗作用。說明根際土壤微生物資源豐富，可為生物防治技術提供可靠支撐。已有報道指出芽孢桿菌生防機制主要為抗生、競爭、促進生長、誘導抗性等[13，14]，就抗生而言有人指出該特性與芽孢桿菌可產(chǎn)生多種多樣的抗菌物質(zhì)有關，主要包括抗生素、細菌素、細胞壁降解酶類、抗菌肽以及其他揮發(fā)性的抗菌物質(zhì)等[15]。何浩等[16]發(fā)現(xiàn)B. amyloliquefaciens X030可產(chǎn)生一個對病原細菌與植物病原真菌具有較強抑制作用的多肽。Arrebola等[17]發(fā)現(xiàn)B. amyloliquefaciens PPCB004產(chǎn)生的Iturin A家族脂肽類化合物對植物病原真菌具有很好的抑制效果。本試驗通過用高溫處理細菌發(fā)酵液后作用于煙草黑脛病病原菌復篩，從中得到10株具有較高拮抗活性的拮抗細菌，經(jīng)分子生物學鑒定全部為芽孢桿菌，對其代表種屬菌株進行纖維素酶及蛋白酶活性檢測發(fā)現(xiàn)均可分泌纖維素酶及蛋白酶。因此推測拮抗芽孢桿菌抑菌機制可能與其分泌的纖維素酶能有效分解纖維素、分泌的蛋白酶能抑制與病原菌正常生長相關菌體蛋白的合成，從而水解病原菌的細胞壁，抑制煙草黑脛病病原菌的生長有關，也可能與芽孢桿菌產(chǎn)生的某種耐高溫物質(zhì)如脂肽或揮發(fā)性物質(zhì)有關，這種耐高溫物質(zhì)有待于進一步研究。

拮抗細菌根部定殖被認為是有效生物防治必備條件，在抑制植物土傳病害中起到重要作用[18]。拮抗細菌定殖于植物組織抑制病原菌可能與其生物膜的形成、競爭植物寄生病原菌生態(tài)位和營養(yǎng)、引起植物誘導系統(tǒng)抗性有關。Ren等[19]利用Paenibacillus polymyxa C5制成的有機肥施用于煙草根部可使煙草黑脛病發(fā)病率降低50%，進一步研究得出主要抑菌機制與其可在煙草根部穩(wěn)定定殖有關。Lee等[20]從野生人參中分離一株解淀粉芽孢桿菌HK34可引起人參誘導系統(tǒng)抗性有效抑制惡疫霉生長。本研究利用利福平標記拮抗芽孢桿菌，在不同時間點回收帶有利福平抗性的芽孢桿菌，探究3種拮抗芽孢桿菌在根際土壤以及煙草根和莖組織中的定殖情況，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌GJ7在根部和莖部定殖能力較另外兩種芽孢桿菌好。通過田間試驗比較發(fā)現(xiàn)，GJ7防治效果明顯高于化學藥劑和定殖能力較弱的另外兩種芽孢桿菌，從而證明了拮抗芽孢桿菌田間防治效果與植物組織定殖能力有關。

下一步將從芽孢桿菌引起植物誘導系統(tǒng)抗性進行深入研究，為芽孢桿菌在生物防治中的應用提供理論基礎。

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