大豆GmLEA的分離及其在種子活力中的功能分析

周亞麗，朱雅婧，趙飛云，王爽，劉骕骦，郭凌凱，趙海紅，麻浩

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大豆的分離及其在種子活力中的功能分析

周亞麗，朱雅婧，趙飛云，王爽，劉骕骦，郭凌凱，趙海紅，麻浩

（南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，南京 210095）

【目的】大豆（(L.) Merr.）種子從發(fā)育成熟期（R6或R7期）開始具有活力，在此時期容易受到高溫高濕脅迫，導致種子活力下降。通過對的研究，揭示其高溫高濕脅迫下的表達水平以及功能，為一步深入研究在參與大豆種子活力形成及響應非生物脅迫等方面奠定基礎。【方法】利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，以寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號葉片的cDNA為模板，分離大豆的cDNA序列全長。通過NCBI網站Blast對GmLEA同源性氨基酸序列進行搜索，使用MEGA 6.0和DNAMAN多重比對蛋白質序列，并采用MEGA 6.0的N-J算法構建進化樹。通過酵母雙雜交試驗驗證GmLEA與GmCDPKSK5在酵母體內的互作。構建亞細胞定位和雙分子熒光互補（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）載體，通過基因槍介導法轉化煙草葉片分析GmLEA與GmCDPKSK5在煙草葉片細胞內的互作及其編碼蛋白的亞細胞定位。利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）對的組織特異性表達及其在高溫高濕脅迫下的表達進行分析。構建pBI121融合表達載體，通過農桿菌介導法獲得3個純合的T3代過表達擬南芥株系，對高溫高濕脅迫下擬南芥的種子活力進行分析?！窘Y果】獲得大豆的cDNA序列全長，該基因包含一個長1 377 bp的開放閱讀框（ORF）；且該基因所編碼的蛋白定位在煙草葉片細胞的細胞膜上。酵母雙雜交試驗與雙分子熒光互補（BiFC）試驗結果表明，GmLEA與GmCDPKSK5分別在酵母體內與煙草葉片細胞的細胞膜上存在特異性互作。組織特異性分析結果表明，主要在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號2個品種發(fā)育和成熟的種子中表達。在湘豆3號種子發(fā)育過程中的表達量呈先上升后下降的趨勢，在開花后50 d達最大值，在寧鎮(zhèn)1號種子發(fā)育過程中該基因的表達量呈上升的趨勢，在開花后60 d達到最大值。高溫高濕脅迫后，與對照相比，在湘豆3號中96 h時下調表達，其余時間點均上調表達，在寧鎮(zhèn)1號中，僅24 h時下調表達。過表達擬南芥株系經高溫高濕脅迫后的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及種子活力均顯著（＜0.01）高于野生型植株?！窘Y論】參與高溫高濕脅迫下種子活力的形成，與GmCDPKSK5存在特異性互作，二者可能共同參與高溫高濕脅迫下種子活力的形成。

大豆；；；高溫高濕；種子活力

0 引言

【研究意義】大豆是世界上最重要的飼糧兼用作物，可作為植物蛋白最主要來源之一。中國南方是春大豆生產的重要區(qū)域，然而在春大豆種子發(fā)育成熟時期（R6或R7期），該地區(qū)常處于高溫、多雨、高濕的季節(jié)（6月底—8月初），同時大豆籽粒大，蛋白、脂肪和水分含量高，導致種子田間劣變嚴重，種子活力下降[1]。因此，耐高溫高濕的大豆新品種的選育尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】種子活力（seed vigor）是一種以植物生理學、生物化學和遺傳學為根本的種子生理學方面的一個新領域[2]。通常來說，種子活力的高低主要是由遺傳因子和種子發(fā)育過程中的條件一起決定的[3]。種子成熟后，會開始走向衰老和劣變即老化，這一過程是不可逆的。種子老化與其貯藏條件密切相關，其中高溫高濕的環(huán)境是引起種子老化的重要因素。一般來說，種子老化后，會造成活力降低，細胞質膜完整性破壞，內部保護酶系統(tǒng)活性降低，脂質過氧化加劇、有毒有害物質積累等[4]。目前，對于種子收獲和儲藏時種子發(fā)生劣變從而導致大豆種子活力降低的各種因素已成為研究的熱點[5-9]。大豆在種子發(fā)育成熟期遭遇高溫、多雨的天氣會導致種子活力降低、營養(yǎng)品質和外觀品質下降[3,5,10-11]，高溫高濕脅迫已成為造成大豆種子劣變的重要原因之一[12]。關于高溫高濕脅迫后對種子活力影響生理方面的研究已取得重大進展，但關于分子機制的研究較少。近幾年，關于分子機制的研究取得了一定的進展。在不抗種子田間劣變春大豆種質寧鎮(zhèn)1號和抗種子田間劣變春大豆種質湘豆3號生理成熟期，宋利茹等對其進行模擬田間高溫高濕脅迫處理，通過2-DE電泳和MALDI-TOF/TOF鑒定了33個差異蛋白，這些蛋白在貯藏蛋白、轉運過程、氧化還原平衡、能量代謝、蛋白合成等代謝途徑與細胞過程中發(fā)揮作用[13]。王爽[1]研究發(fā)現在響應高溫高濕脅迫中發(fā)揮重要作用，并以GmCDPKSK5為誘餌，構建高溫高濕脅迫下抗種子田間劣變春大豆種質種子膜蛋白酵母雙雜交文庫，篩選到6個與之互作的蛋白，GmLEA是篩選到的互作蛋白之一。LEA蛋白的積累與抵抗逆境脅迫之間存在正相關的關系，普遍認為其在應對外界脅迫中發(fā)揮著重要作用[14-15]。研究表明，LEA蛋白具有廣泛的功能，對ABA、低溫、鹽害與干旱等非生物脅迫都具有一定的抵抗作用，在保護酶活性與膜結構、結合金屬離子、清除活性氧自由基等方面均發(fā)揮作用[16-17]。【本研究切入點】據報道，多種蛋白質已被證明與CDPK蛋白相互作用，并在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但關于LEA蛋白與CDPK的相互作用鮮有報道，王爽[1]通過酵母雙雜篩選，初步篩選到GmLEA是GmCDPKSK5的互作蛋白之一?！緮M解決的關鍵問題】本研究克隆大豆，并對其編碼的蛋白進行亞細胞定位；分析GmLEA與GmCDPKSK5的互作情況；研究其在高溫高濕脅迫下的表達水平及功能。以期為進一步深入研究在參與大豆種子活力形成和響應非生物脅迫等方面奠定基礎，從而為探明田間高溫高濕脅迫下春大豆種子活力形成的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大豆材料為南京農業(yè)大學作物遺傳與種植創(chuàng)新國家重點實驗室麻浩教授課題組保存的抗種子田間劣變春大豆品種湘豆3號和不抗品種寧鎮(zhèn)1號。試驗所需大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自南京博爾迪生物技術公司；GV3101擬南芥遺傳轉化菌株購自南京百思禾生物科技有限公司；pMD19-T載體購自TaKaRa公司；植物瞬時表達載體pA7-GFP、雙分子熒光互補（BiFC）載體pSAT1-nEYFP-C1與pSAT1-cEYFP- C1-B、酵母雙雜交試驗載體pPR3N-NubG-X、pOST1- NubG與pBT3-SUC以及植物表達載體pBI121-GUS均由麻浩教授課題組保存。

1.2 總DNA和RNA的提取及cDNA的合成

以2周苗齡的大豆幼葉為材料，按照CTAB法提取DNA，參照杭州寶賽新型植物總RNA提取試劑盒說明書提取大豆各種材料的RNA，采用TaKaRa公司的RTase M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大豆GmLEA的分離與進化樹分析

研究所用的引物以NCBI（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）公布的（Genbank：NM_001251272.1）的CDS序列及DNA序列作為模板，使用Primer Premier5.0軟件設計引物（電子附表1），對湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號的DNA與cDNA模板進行PCR擴增。PCR體系與反應程序參照王爽[1]的研究。PCR產物經檢測后回收、連接，并轉化。挑取陽性克隆送上海鉑尚生物技術有限公司測序，將測序正確的陽性克隆命名為T-GmLEA。通過NCBI的BLASTN分別對nr數據庫和EST數據庫同源性搜索，BLASTX對nr數據庫進行相似性搜索；使用MEGA 6.0和DNAMAN多重比對蛋白質序列；采用MEGA 6.0的N-J算法構建進化樹， BootStrap值為1 000。

1.4 酵母雙雜交試驗

pBT3-SUC-GmCDPKSK5與pPR3N-GmLEA載體由麻浩教授課題組保存。將pBT3-SUC-GmCDPKSK5與pPR3N-GmLEA共轉入酵母菌株NMY32中，四缺（SD/-Trp-Leu-His-Ade）培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)篩選陽性克隆。pNubG-Fe65與pTSU2-APP質粒組合為陽性對照，pPR3N與pTSU2-APP質粒組合為陰性對照，pPR3N與pBT3-SUC-GmCDPKSK5質粒組合為自激活對照，pPR3N-GmLEA與pBT3-SUC為自激活對照。使用HTX高通量β-半乳糖苷酶試劑盒（Dualsystems Biotech，Swiss）測定β-半乳糖苷酶活性。

1.5 GmLEA蛋白的亞細胞定位

通過設計的ORF引物，利用限制性內切酶Ⅰ和Ⅰ對pA7空載和目的片段進行酶切，并通過酶切重組的方法將目的基因構建到pA7-GFP表達載體上，獲得pA7-GmLEA-GFP重組載體。取葉脈較少的煙草葉片并剪去主脈，葉片背面朝上平貼于MS培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)。使用PDS-1000/He基因槍（Bio-Rad）將重組質粒轉化到煙草葉片細胞中，25℃暗培養(yǎng)16 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP蛋白表達信號。

1.6 雙分子熒光互補試驗

通過對和的ORF進行引物的設計，利用限制性內切酶Ⅰ和HⅠ對nE-YFP和cE-YFP 2個空載和目的片段進行酶切，并通過酶切重組的方法將目的基因分別構建到nE-YFP和cE-YFP 2個載體上，共得到nE-GmCDPKSK5和cE-GmLEA 2個重組載體。采用上述1.5相同的方法將重組質粒轉化到煙草葉片細胞中，25℃暗培養(yǎng)16 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察YFP蛋白表達信號。

1.7 GmLEA的表達分析

將大豆種子播種于塑料花盆中，每盆約3—5粒種子；并將其置于正常條件下生長。當大豆生長至R6與R7之間時，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，模擬田間高溫高濕環(huán)境條件進行處理，正常環(huán)境中生長植株為對照。大豆植株正常生長條件與處理條件見表1。在處理期間的0、24、48、96和168 h收集來自處理和對照植物中部的種子。

當大豆生長至一節(jié)期（V1）時，采集大豆植株的子葉、根、莖及葉；花取自其盛花期（R2）；幼莢和幼嫩的豆粒取自盛莢期（R4）；成熟的莢和成熟的豆粒取自完熟期（R8），進行組織特異性表達分析。

表1 植物生長條件

當大豆植株處于盛花期（R2）時，選取植株上部的花在花柄處掛牌并標注日期，從花后15 d開始到花后60 d結束，每隔5 d取一次樣，收集整個莢，進行種子發(fā)育時期分析。

所有樣品取樣后立即于液氮中冷凍，-80℃保存?zhèn)溆?。參照WANG等[18]方進行法qRT-PCR分析，設置3次重復。

1.8 擬南芥轉化及轉基因純合植株的獲得

將的ORF區(qū)域構建到pBI121-GUS 植物過表達載體上，該載體主要包括Kan抗性基因、CaMV35S啟動子和。通過農桿菌介導法轉化野生型擬南芥（WT）。經篩選鑒定得到3個過表達陽性株系LEA-1、LEA-2和LEA-3，分別收獲純合的T3代過表達擬南芥種子進行功能分析。

1.9 過表達擬南芥種子生活力與活力指標的測定

按表1將WT、pBI121-GUS過表達和過表達植株莢黃熟期的植株處理2 d，同時設置對照。

待種子收獲后，處理組和對照組各株系擬南芥種子各取100粒，進行TTC染色，種胚全部或大部分被染成紅色的為具有生活力的種子，反之為死種子，觀察種子生活力。另外，分別取100粒種子點播于MS培養(yǎng)基上，從播種后的第1天至第5天，每半天記錄一次種子的發(fā)芽數，稱取第5天擬南芥幼苗重量，統(tǒng)計種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數、活力指數及平均發(fā)芽天數。

1.10 數據處理

使用軟件DPS進行方差（ANOVA）分析，檢測差異顯著性。

2 結果

2.1 GmLEA的分離與進化樹分析

以湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號的cDNA為模板進行PCR擴增，在1 377 bp處有與預期大小相同的特異性條帶，經測序發(fā)現該基因的cDNA序列在2個品種間沒有差異。以湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號的DNA為模板，經PCR擴增得到長度為1 879 bp的DNA序列。進化樹分析結果顯示，按科分為4大類，分別為豆科（Leguminosae）、蝶形花科（Papilionaceae）、葫蘆科（Cucurbitaceae）和小桿科（Rhabditidae），GmLEA與豆科的LEA蛋白親緣關系比較近（圖1）。

2.2 GmLEA與GmCDPKSK5的酵母雙雜交驗證

由圖2可知，全部質粒組合均在SD-TL（SD/-Trp- Leu）培養(yǎng)基上正常生長，說明全部質粒組合均成功轉入酵母細胞，只有pNubG-Fe65與pTSU2- APP和pPR3N-GmLEA與pBT3SUC-GmCDPKSK5 2個質粒組合能夠正常生長在SD-TLHA（SD/-Trp-Leu- His-Ade）培養(yǎng)基上且能被X-α-Gal染成藍色，而其他3個質粒組合的酵母細胞不能在SD-TLHA培養(yǎng)基上生長，且pPR3N-GmLEA與pBT3SUC-GmCDPKSK5質粒組合的β-半乳糖苷酶活性值顯著高于3個質粒組合，表明GmLEA與GmCDPKSK5在酵母體內存在特異性互作。

2.3 GmLEA的亞細胞定位

采用基因槍介導法將融合表達載體共轉入煙草葉片細胞中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光位置。發(fā)現pA7-GmLEA-GFP融合蛋白在煙草葉片細胞細胞膜上表達且與膜Marker蛋白pm-ck CD3-1001信號重合，而pA7-GFP空載分布在煙草葉片細胞的整個細胞中（圖3）。結果表明，GmLEA定位于煙草葉片細胞膜上。

Gm：大豆Glycine max，NP001238201.1；Gs：野生大豆Glycine max，KHN03228.1；Cc：木豆Cajanus cajan，KYP57744.1；Va：紅豆Vigna angularis，XP017413051.1；Pv：菜豆Phaseolus vulgaris，XP007154470.1；Ts：地三葉草Trifolium subterraneum，GAU16739.1；Mt：蒺藜苜蓿Medicago truncatula，XP003609877.1；Ms：紫花苜蓿Medicago sativa，ACD14089.1；La：狹葉羽扇豆Lupinus angustifolius，OIV95293.1；Cm：甜瓜Cucumis melo，ADN34043.1；Aa：小花南芥Arabis alpina，CCO06495.1；Ce：秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans，NP001256172.1；蝶形花科 Papilionaceae；豆科Leguminous；葫蘆科Cucurbitaceae；小桿科Rhabditidae

圖2 GmLEA與GmCDPKSK5蛋白的酵母雙雜交驗證

2.4 BiFC驗證GmLEA與GmCDPKSK5互作

采用基因槍介導法將融合表達載體共轉入煙草葉片細胞中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光位置。將nEYFP-GmCDPKSK5與cEYFP-GmLEA質粒共轉入煙草葉片細胞中，在煙草葉片細胞的細胞膜上可觀察到有黃色熒光分布，并且與膜Marker蛋白pm-ck CD3-1001信號重合，而nEYFP與cEYFP-GmLEA、nEYFP-GmCDPKSK5與cEYFP和nEYFP與cEYFP質粒組合共轉入煙草葉片中沒有觀察到黃色熒光（圖4）。說明GmLEA與GmCDPKSK5蛋白主要在煙草葉片細胞的細胞膜上發(fā)生特異性互作。

2.5 GmLEA的組織表達分析

為了解在大豆不同組織器官的表達特性，通過qRT-PCR分別檢測了在湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號不同組織器官中的表達情況。主要在2個品種發(fā)育中的種子及成熟的種子中表達，在莢中有少量表達，在根、莖、葉、花和子葉中幾乎無表達（圖5）。

圖3 GmLEA在煙草葉肉細胞中的亞細胞定位

圖4 GmLEA與GmCDPKSK5蛋白在煙草葉片細胞中的BiFC驗證

2.6 大豆種子發(fā)育過程中GmLEA的表達特性

通過組織表達特性分析，發(fā)現在湘 豆2號和寧鎮(zhèn)1號種子中的表達量很高，進一步分析了該基因在2個品種種子發(fā)育過程中的表達水平。結果表明，在湘豆3號種子發(fā)育過程中表達量先上升后下降，并且在開花后50 d達到 最大值。在寧鎮(zhèn)1號種子發(fā)育過程中表達量呈上升的趨勢，并且在開花后60 d達到最大值（圖6）。結果表明，可能參與了種子發(fā)育過程。

不同大寫字母表示在P＜0.01水平差異顯著

圖6 大豆種子發(fā)育過程中GmLEA的相對表達量

2.7 高溫高濕脅迫下GmLEA的表達特性

大豆植株在種子生理成熟期經高溫高濕脅迫處理后，在湘豆3號種子中，僅在96 h下調表達，在其余時間點均上調表達，且在24、48、96和168 h差異達極顯著（＜0.01）水平；在寧鎮(zhèn)1號種子中，的表達量僅在24 h低于對照組，在其余時間點表達量均高于對照組，且在48 h和96 h差異達極顯著（＜0.01）水平（圖7）。結果表明，響應高溫高濕脅迫，并推測其可能參與春大豆種子田間劣變抗性過程。

2.8 高溫高濕脅迫下GmLEA過表達擬南芥種子的活力分析

通過對種子進行高溫高濕脅迫，在正常生長條件下，所有植株的種子在第5天發(fā)芽率均能達到90%左右，且都能正常生長為幼苗；而經高溫高濕脅迫后，各個株系種子的發(fā)芽率均有所下降，但過表達植株下降的幅度最小，狀態(tài)要好于其他2個株系（圖8-A和圖8-B）。TTC染色結果與種子萌發(fā)的結果基本一致（圖8-C）。表2顯示高溫高濕脅迫后，過表達植株、pBI121-GUS過表達植株與WT植株的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數均顯著（＜0.01）低于對照組，但是過表達植株優(yōu)于（＜0.01）其他2個株系；而WT、pBI121-GUS過表達株系和過表達株系種子的平均發(fā)芽天數比對照組均有所提高，過表達植株種子的平均發(fā)芽天數低于WT、pBI121-GUS過表達植株。結果表明，高溫高濕脅迫后過表達株系的種子活力顯著高于野生型。

A：湘豆3號；B：寧鎮(zhèn)1號。**表示差異極顯著（P＜0.01）

表2 高溫高濕處理對擬南芥種子萌發(fā)特性的影響

同列不同大寫字母表示在＜0.01水平差異顯著

Different capital letters in the same column indicate significant difference at＜0.01 level

A：播種7 d后的經高溫高濕處理2 d收獲的野生型和轉基因株系幼苗；B：對照條件下與經高溫高濕處理的種子發(fā)芽率；C：經高溫高濕處理的種子TTC染色，bar=2 mm

3 討論

3.1 GmLEA的表達分析

LEA蛋白是一類在生物體內廣泛存在的蛋白質，它參與植物抵抗脅迫和滲透調節(jié)等過程，在植物的不同器官中都有LEA蛋白的廣泛分布，不僅在高等植物種子中分布，花粉管和營養(yǎng)組織中也有分布，主要在種子胚胎發(fā)育后期積累[19-21]。有研究表明LEA在種子發(fā)育過程中逐漸積累[22]。本研究中組織特異性表達結果顯示在種子中大量表達，由此推測可能參與種子的發(fā)育；但值得注意的是在寧鎮(zhèn)1號種子發(fā)育該基因表達低于湘豆3號種子，通過2個品種中該基因的序列比對，發(fā)現其在2個品種間沒有差異，因此，推測該基因在2個品種中差異表達可能是由于該基因在不同大豆品種的啟動子序列或者上游調控基因的差異造成的，關于造成該基因轉錄模式差異的具體原因尚不明確，還需進一步研究中。

3.2 GmLEA參與高溫高濕脅迫反應

有研究表明，在干旱脅迫下，植物體內的LEA蛋白的構象會發(fā)生變化，形成α螺旋結構，可以和膜脂結合從而阻止水分的進一步喪失[23]。Liu等[24]研究發(fā)現蠟梅（Link）中過表達能夠在一定程度上加強過表達擬南芥對低溫脅迫的抵抗能力。大豆中的2個LEA蛋白，即GmPM1和GmPM9都可以通過C端的組氨酸與Cu2+和Fe3+結合，以清除羥基自由基，減少金屬離子的毒害[25]。柑橘中的脫水素Cucor19能夠清除羥基自由基和過氧化氫，一定程度上減輕活性氧自由基對植物造成的傷害[26]。目前關于LEA蛋白的功能已經有許多研究，但是該類蛋白在高溫高濕方面的研究鮮有報道。本研究發(fā)現在轉錄水平上響應高溫高濕脅迫。此外，高溫高濕脅迫處理后收獲的過表達植株種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數、活力指數均優(yōu)于WT和pBI121-GUS過表達植株，且過表達植株種子的平均發(fā)芽天數明顯縮短。因此可以推測高溫高濕脅迫后過表達可以提高擬南芥種子的活力。

3.3 GmLEA與GmCDPKSK5相互作用

據報道，許多蛋白質已被證明與CDPK蛋白相互作用，并在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。AtCPK10與HSP1相互作用，在調節(jié)由ABA和鈣離子介導的氣孔運動中發(fā)揮重要作用[27]。麻浩老師課題組前期研究發(fā)現GmCDPKSK5與高溫高濕脅迫下春大豆種子活力的形成相關，以GmCDPKSK5為誘餌構建高溫高濕脅迫下抗種子田間劣變春大豆種子膜蛋白酵母雙雜交文庫，在細胞膜上初步篩選到6個與之互作的蛋白，分別為1個LEA蛋白、1個翻譯控制腫瘤蛋白、1個種子成熟蛋白、1個微粒體油酸脫氫酶以及2個未知功能蛋白[28]。進一步研究發(fā)現，GmCDPKSK5與GmTCTP相互作用并在植物響應高溫高濕脅迫中發(fā)揮重要作用[18]。在本研究中，通過酵母雙雜交試驗驗證了GmLEA與GmCDPKSK5在酵母體內存在特異性互作；又通過BiFC試驗對GmLEA與GmCDPKSK5的互作進行了進一步的驗證，結果發(fā)現二者在煙草葉片細胞的細胞膜上發(fā)生特異性互作。

有趣的是，結合實驗室前期對的研究結果[1]，發(fā)現高溫高濕脅迫后無論是還是都能夠響應高溫高濕的脅迫，而且表達趨勢基本上一致。這種現象一種可能的解釋就是GmLEA與GmCDPKSK5相互作用共同響應大豆種子發(fā)育過程中的高溫高濕脅迫。

基于以上結果，推測GmLEA和GmCDPKSK5相互作用共同對高溫高濕脅迫應激反應，但是GmLEA和GmCDPKSK5如何參與響應高溫高濕脅迫的機制需要進一步研究。

4 結論

從大豆中擴增獲得，其cDNA全長1 377 bp，DNA序列全長1 879 bp，由2個外顯子和1個內含子組成。GmLEA蛋白定位于煙草葉片細胞膜上，與GmCDPKSK5在細胞膜上特異性互作。具有組織特異性表達，在大豆種子中表達量最高；過表達能夠提高擬南芥種子的活力。

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Isolation and Functional analysis of soybeanin seed vigor

ZHOU YaLi, ZHU YaJing, ZHAO FeiYun, WANG Shuang, LIU SuShuang, GUO LingKai, ZHAO HaiHong, MA Hao

(National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

【Objective】Soybean((L.) Merr.) seed generally form vitality from their physiological maturity period(R6 or R7 period). However, the seed is susceptible to high temperature and humidity (HTH) stress during this period. This will lead to a decline in seed vigor. The results will lay a foundation for further studying the mechanism of seed vigor formation under abiotic stress. 【Method】Primer Premier 5.0 was used to design primers, and the full length cDNA sequence ofwas isolated by using the cDNA of leaves of cv. Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3 as template. The homologous amino acid sequence of GmLEA was searched by BLAST at NCBI, the protein sequences were multiple aligned using MEGA 6.0 and DNAMAN, and the phylogenetic tree was constructed using the N-J algorithm of MEGA 6.0. Yeast two-hybrid experiments were performed to verify the interaction of GmLEA and GmCDPKSK5 in yeast. A subcellular localization and bimolecular fluorescent complementation (BiFC) vector were constructed, The interaction between GmLEA and GmCDPKSK5 in tobacco leaf cells and the subcellular localization of the encoded protein were analyzed by gene-gun-mediated transformation of tobacco leaves. In addition, the tissue-specific expression ofgene and the expression pattern ofgene under HTH were analyzed by qRT-PCR, respectively. The pBI121 fusion expression vector was constructed and three homozygous overexpressedlines were obtained through Agrobacterium- mediated method, and three independent homozygous T3transgenic lines were used for analysis. 【Result】The cDNA sequence ofgene contains a 1 377 bp open reading frame (ORF), and the subcellular localization result showed that the encoded protein was located on the cell membrane. The results of yeast two-hybrid rotation verification showed that GmLEA could interact with GmCDPKSK5 in yeast. In addition, bimolecular fluorescence complementation (BiFC) experiment showed that GmLEA could interact with GmCDPKSK5 on cell membrane of tobacco leaf cells. The results of tissue-specific analysis showed thatgene had higher expression levels in developing and mature seeds of both cultivars. The expression level ofwas increased first and then decreased during the development of cv. Xiangdou No. 3 seeds. During the process of seed development of cv. Ningzhen No.1, the level ofexpression was on the rise and reached the highest at 60 days after flowering. After high temperature and high humidity (HTH) stress, the expression ofwas decreased at 96 h in cv. Xiangdou No. 3, and the other time points were increased. However, the expression was decreased at 24 h in cv. Ningzhen No.1. The germination potential, germination rate and seed vigor ofgene in transgenicthaliana were significantly (＜0.01) higher than those of the wild type plants under HTH stress. 【Conclusion】Theis involved in the formation of seed vigor under HTH stress，and has specific interaction with GmCDPKSK5, It is speculated that they may participate in the formation of seed vigor under HTH stress.

soybean;;; high temperature and high humidity stress; seed vigor

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.001

2018-06-22；

2018-07-29

國家自然科學基金（31671772，31371711）、科技部國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0100905）

周亞麗，Tel：15062270213；E-mail：807834731@qq.com。

麻浩，Tel：025-84395324；E-mail：Lq-ncsi@njau.edu.cn

（責任編輯 李莉）