月見草莖提取物的抗氧化活性研究

陳 琦, 張可鑫, 崔明勛, 姜 君

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 132002)

月見草是屬柳葉菜科月見草屬植物，為1～2年生或多年生草本，生長于山區(qū)向陽坡地、林間或林原荒地等，主要分布于美洲溫帶地區(qū)、歐洲及亞洲，在我國主要分布于東北地區(qū)。月見草含有多種生物活性成分，如類固醇、萜類化合物、黃酮類等，具有抗炎、調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇的作用[1]。目前，關(guān)于月見草生物活性研究大多集中在其種子上，而對占整株70%以上的莖研究甚少。黃酮類物質(zhì)可有效清除機體內(nèi)自由基，延緩細(xì)胞衰老，因此，黃酮類物質(zhì)的存在被認(rèn)為是抗氧化反應(yīng)的重要基礎(chǔ)[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)月見草莖中含有較多的黃酮類成分[6]，可以推測其具有一定的抗氧化活性。一般來說，自由基過多會使細(xì)胞發(fā)生超氧化，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變[7-8]，進而引起其它疾病，如急性肺損傷，關(guān)節(jié)炎等，活性物質(zhì)的抗氧化性主要是評價其對氧自由基的清除能力。

急性肺損傷是由直接或間接因素導(dǎo)致的肺部損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞浸潤及多種細(xì)胞因子的過度表達(dá)，其臨床癥狀為呼吸困難和進行性低血氧癥，目前尚無有效的治療措施。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是急性肺損傷的重要發(fā)病機制之一[9-10]?？寡趸瘎┛梢越档兔?xì)血管通透性，增強對感染的抵抗力，可治療急性肺損傷[11]。谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是典型的過氧化酶，髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)活性可以反應(yīng)機體的氧化應(yīng)激程度，活性及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，因此肺組織中的GSH-Px、CAT、SOD、MPO活性和MDA含量可作為評價肺損傷程度的指標(biāo)。該試驗通過體內(nèi)和體外試驗研究月見草莖提取物的抗氧化活性，為今后月見草莖作為抗氧化相關(guān)產(chǎn)品的原材料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

月見草全株購于亳州大德堂藥業(yè)有限公司；BALB/c 小鼠(雌性，6 周齡，22～25 g)購買于長春億斯試驗動物有限公司；GSH-Px、SOD、CAT、MDA和MPO檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；ABTS、過硫酸鉀購于索萊寶科技有限公司。菲啰嗪購于上海源葉生物科技有限公司。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，地塞米松(DEX)購于Singma公司。

1.2 方法

1.2.1 月見草莖提取物總黃酮含量測定

參考吳榮志等[12]的方法。稱取0.1 g月見草莖，加入10 mL 70%乙醇，60 ℃水浴2 h后用蒸餾水定容至25 mL，依次加入5%亞硝酸鈉和4%氫氧化鈉溶液。以40 μg/mL蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長510 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算月見草莖的總黃酮含量。

稱取1 g月見草莖，加入80 mL甲醇、5 mL鹽酸和15 mL去離子水，冷凝回流1 h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL，用25 mL乙酸乙酯萃取3次后，合并上層液體，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋至干粉狀，加入5 mL色譜甲醇溶解，膜過濾后用于HPLC分析。標(biāo)準(zhǔn)品楊梅素、槲皮素、表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷及山奈酚-3-O-蕓香糖的純度均大于98。

1.2.2 月見草莖提取物對自由基清除活性的影響

稱取干粉50 g月見草莖并研磨，用500 mL的70%乙醇提取3次，每次1 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干粉狀。

取不同濃度月見草莖提取物樣品1 mL至試管中，加入1 mL 濃度為 0.1 mmol/L的 DPPH溶液，避光反應(yīng) 30 min，于517 nm測量吸光度，以加入等量的超純水作為空白對照，計算DPPH的清除活性[13]。將不同濃度的樣品與0.1 mL的亞油酸反應(yīng)，用紫外燈照射2 h，加入三氯乙酸4 mL和硫代巴比妥酸1 mL于95 ℃反應(yīng) 90 min后，于532 nm處測量吸光度計算對烷基自由基的清除活性[14]。

參照并改進范金波等[15]的方法，對ABTS自由基清除活性進行檢測。將7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀(v∶v=1∶1)混合均勻后，在室溫條件下避光反應(yīng)16 h。為測定清除活性，將1 mL ABTS試劑與 20 μL提取物混合，并在室溫下反應(yīng)6 min后在734 nm處測量吸光度，計算對ABTS的清除率。

取樣品1 mL 至試管中，加入2.75 mL蒸餾水和0.05 mL 2 mmol/L FeCl2溶液，搖勻，加入0.2 mL、5 mmol/L菲咯嗪，室溫靜置10 min。以0.05 mL蒸餾水代替 0.05 mL FeCl2溶液為對照組，以 1 mL 蒸餾水代替 1 mL 樣品稀釋液為空白組，于紫外分光光度計562 nm 處測定OD 值，并計算鐵離子鰲合能力。

1.2.3 月見草莖提取物對ALI小鼠體內(nèi)抗氧化活性的影響

將BALB/c小鼠分為5組，每組6只：1-正常組，2-LPS組，3-低劑量組，4-高劑量組，5-陽性對照組。其中，正常組和LPS組灌胃生理鹽水7 d；低和高劑量組分別用2.5和5 mg/kg月見草提取物灌胃7 d；陽性對照組用生理鹽水灌胃5 d后連續(xù)2 d用7.8 mg/kg地塞米松(DEX)腹腔注射。

除正常組外，灌胃7 d后，均滴鼻LPS(5 mg/kg)，24 h犧牲小鼠。摘取小鼠右肺組織，在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗2次，以重量體積比為1∶19加入試劑盒中勻漿介質(zhì)，將肺組織研磨后取上清液，即為5%組織勻漿液。根據(jù)試劑盒方法分別測定肺組織勻漿中的GSH-Px、CAT、SOD、MPO活性及MDA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 月見草莖中黃酮含量

植物的抗氧化性與其黃酮含量密不可分。本研究發(fā)現(xiàn)，月見草莖中總黃酮含量為43.29 mg/g DW，其中，楊梅素4.35 mg/g DW、槲皮素4.87 mg/g DW，表兒茶素沒食子酸酯6.79 mg/g DW，槲皮素-3-O-葡萄糖苷2.45 mg/g DW，山奈酚-3-O-蕓香糖5.03 mg/g DW(圖1)。說明月見草莖中含有較多的黃酮類物質(zhì)。

1:楊梅素;2:槲皮素;3:表兒茶素沒食子酸酯;4:槲皮素-3-O-葡萄糖苷;5:山奈酚-3-O-蕓香糖

2.2 月見草莖提取物體外抗氧化活性

不同濃度的月見草莖提取物對DPPH自由基的清除活性有差異，隨著月見草提取物濃度的增加，清除DPPH的活性不斷增強，當(dāng)月見草莖提取物濃度達(dá)到32 μg/mL時，清除率達(dá)到最高并保持在最高水平，為84%(圖2)。不同濃度的月見草對烷基自由基的清除活性也有差異，隨著月見草提取物濃度的逐漸增加，烷基自由基的清除活性不斷增強，當(dāng)月見草莖提取物濃度達(dá)到32 μg/mL時，清除率達(dá)到最大，為90%(圖3)。月見草莖提取物對ABTS自由基的清除活性有劑量依賴性的作用，隨著月見草提取物濃度的增加，清除烷基自由基的活性不斷增強，且當(dāng)月見草莖提取物濃度達(dá)到1 mg/mL時，清除率達(dá)到最大，為78%(圖4)。對鐵離子螯合能力進行測定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著月見草莖提取物濃度的逐漸升高，鐵離子螯合能力也逐漸增強,當(dāng)提取物濃度為5 mg/mL時，鐵離子螯合能力效果最佳，為34%(圖5)。

圖2 月見草莖提取物對DPPH自由基清除活性的影響

圖4 月見草莖提取物對ABTS自由基清除活性的影響

2.3 月見草莖提取物體內(nèi)抗氧化活性

用LPS刺激小鼠肺部可造成肺泡毛細(xì)血管膜損害，使氧自由基釋放，因此可以通過檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)來評價肺損傷程度。滴鼻LPS后，每隔8 h觀察小鼠狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠精神狀態(tài)良好；LPS組小鼠精神沉郁，被毛逆立。研磨小鼠肺組織獲取勻漿液，使用試劑盒檢測5種氧化應(yīng)激相關(guān)因子活性及含量(表1)。

由表1可知，LPS組小鼠肺組織中GSH-Px、CAT、SOD活性顯著降低(P<0.01)，而MPO活性和MDA含量顯著升高(P<0.01)，表明急性肺損傷模型造模成功。DEX與疾病模型組相比，GSH-Px、CAT、SOD活性極顯著升高(P<0.01)，MPO活性極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)。月見草莖提取物2.5 mg/kg組MPO活性極顯著降低(P<0.01)，其他4項指標(biāo)無顯著性差異。月見草莖提取物5 mg/kg組GSH-Px、CAT活性極顯著升高(P<0.01)，CAT活性顯著升高(P<0.05)，MPO活性極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)。表明月見草莖提取物能夠調(diào)節(jié)急性肺損傷小鼠肺臟中抗氧化酶活性，提高GSH-Px、及CAT、SOD活性，降低MPO活性和MDA含量。

表1 月見草莖提取物對肺組織GSH-Px，CAT，SOD，MPO活力及MDA含量的影響

注:正常組與LPS組比較，##P<0.01；月草莖低劑量組、月見草高劑量組、陽性對照組與LPS組比較，*P<0.05，**P<0.01.

3 討論與結(jié)論

自由基在氧化過程中起重要作用。自由基也稱“游離基”，是指化合物的分子在光熱等外界條件下，共價鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團。黃酮類化合物作為一種天然的抗氧化劑，可以與鐵離子絡(luò)合，切斷羥基自由基的生成；通過與超氧陰離子反應(yīng)，制止自由基反應(yīng)引發(fā)；與脂質(zhì)過氧化基結(jié)合，阻斷脂質(zhì)過氧化過程[16]。該試驗結(jié)果顯示，月見草莖提取物含有較高的黃酮含量(43.29 mg/g·DW)，可以推測其具有較強的抗氧化活性。

大量研究表明，很多疾病的發(fā)生都與自由基的產(chǎn)生有緊密聯(lián)系。機體通過酶系統(tǒng)或非酶系統(tǒng)產(chǎn)生自由基，對機體產(chǎn)生損傷。GSH-Px、CAT和 SOD 是典型的抗氧化酶，可拮抗機體氧化應(yīng)激水平[17]。MPO是存在于中性粒細(xì)胞的一種酶，MPO升高，表明組織中有炎性細(xì)胞浸潤，組織受到損傷[18]。大量的自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用并生成過氧化產(chǎn)物MDA，它的含量可顯示機體受自由基攻擊的程度[19]。本研究結(jié)果顯示，月見草莖提取物可提高GSH-Px、CAT和SOD活性，降低MPO活性和MDA含量，說明月見草莖具有較好的抗氧化活性，其作用機制可能與減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎性細(xì)胞浸潤程度以及提高抗氧化酶活性有關(guān)。因此，月見草莖提取物可提高自由基的清除活性，調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型的小鼠氧化相關(guān)指標(biāo)，具有較高的抗氧化活性，因此作為原材料可用于今后抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用上。