miR-4286與 AEG-1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

趙華 陳瑩蓉 宋鵬濤 余才華 吳巍 馬志紅

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)居各種惡性腫瘤之首[1]。腫瘤根據(jù)病理學(xué)類型可分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC約占85%。近年研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等進(jìn)程中起著重要的作用[2-4]。筆者在前期研究中應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)篩選NSCLC組織中差異表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-4286在NSCLC癌組織中的表達(dá)水平顯著升高；進(jìn)一步采用生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，miR-4286與星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因-1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）的啟動(dòng)子區(qū)域互補(bǔ)，miR-4286可能通過(guò)靶向AEG-1啟動(dòng)子序列以激活A(yù)EG-1的轉(zhuǎn)錄或翻譯，共同參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。本研究中筆者采用原位雜交方法和免疫組織化學(xué)染色分別檢測(cè)miR-4286和AEG-1在140例NSCLC癌組織及配對(duì)癌旁正常組織中的表達(dá)，分析兩者表達(dá)水平與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 人NSCLC組織芯片（芯片編號(hào)：HLug-Squ150CS01、HLugA150CS02）購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司。150例NSCLC患者樣本來(lái)源于國(guó)家人類遺傳資源共享服務(wù)平臺(tái)（2005DKA21300），剔除信息不全及脫靶等因素，共入組患者140例，男105例，女35例；年齡 35～72（60.25±9.22）歲；腫瘤直徑≤3cm 102 例，＞3cm 38例；腺癌72例，鱗癌68例；TNM分期：Ⅰ期59例，Ⅱ期45例，Ⅲ期27例，Ⅳ期9例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例，未轉(zhuǎn)移81例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例，未轉(zhuǎn)移131例；腫瘤分化程度：Ⅰ期19例，Ⅱ期84例，Ⅲ期37例。所有患者均經(jīng)臨床確診且術(shù)前未接受放、化療，手術(shù)切除組織包含癌組織和相匹配的距離癌組織邊緣5cm以上的癌旁正常組織。離體組織經(jīng)常規(guī)4%甲醛固定并石蠟包埋，5μm厚度切片，制成直徑1.5mm的組織芯片。

1.2 原位雜交方法 按照丹麥 Exiqon公司的原位雜交試劑盒 miRCURY LNATMmicroRNA ISH Optimization Kit（FFPE）（No.90008）的操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。組織芯片脫蠟水化后，蛋白酶 K（15μg/ml）37℃孵育 15min。將梯度乙醇脫水后的芯片置于55℃預(yù)雜交30min，接著加入90℃變性的地高辛標(biāo)記探針miR-4286（丹麥Exiqon公司，YD00610917-BCG，1∶500）雜交工作液于 55℃孵育過(guò)夜。次日經(jīng)過(guò)梯度洗片和封閉后，加入Anti-DIG-AP（美國(guó) Roche 公司，No.11093274910，1∶800） 室溫孵育1h。最后采用NBT/BCIP染色，核固紅復(fù)染后封片鏡檢。用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS替代探針作陰性對(duì)照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色參照文獻(xiàn)[5]。大體步驟為石蠟切片脫蠟水化后，經(jīng)3%H2O2封閉，高壓法抗原修復(fù)，然后加入兔抗人單克隆抗體AEG-1（英國(guó) Abcam 公司，ab124789，1∶300）4℃孵育過(guò)夜，次日辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物孵育30min，最后采用DAB染色，蘇木素復(fù)染，鏡像觀察。

1.4 結(jié)果判斷 miR-4286和AEG-1在NSCLC癌組織、癌旁正常組織中的陽(yáng)性染色分別為紅色至深紫色和淡黃色至棕褐色。對(duì)陽(yáng)性染色腫瘤細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分。陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞比例：無(wú)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞計(jì)0分，≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分。miR-4286與AEG-1的染色強(qiáng)度評(píng)分分別為：均無(wú)染色計(jì)0分，紅色與淡黃色計(jì)1分（弱染色），紫色與棕黃色計(jì)2分（中等染色），深紫色與棕褐色計(jì)3分（強(qiáng)染色）。最終以陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞比例計(jì)分×染色強(qiáng)度計(jì)分表示miR-4286和AEG-1的表達(dá)水平，0～3分為低表達(dá)，4～9分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中miR-4286與AEG-1的表達(dá) 原位雜交結(jié)果顯示，miR-4286陽(yáng)性染色主要定位于NSCLC癌組織、癌旁正常組織的胞質(zhì)或細(xì)胞核，著色為紅色至深紫色，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。140例NSCLC癌組織中miR-4286高表達(dá)率為62.14%（87/140），高于癌旁正常組織的4.29%（6/140），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，AEG-1陽(yáng)性染色主要位于胞質(zhì)、核膜和細(xì)胞連接處。在NSCLC癌組織中AEG-1中等染色，呈棕黃色；在癌旁正常組織中AEG-1染色缺失或弱染色，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。NSCLC癌組織中AEG-1高表達(dá)率為 55.71%（78/140），高于癌旁正常組織的7.86%（11/140），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 miR-4286和AEG-1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 miR-4286高表達(dá)與患者腫瘤直徑大小、腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤組織類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。AEG-1高表達(dá)與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑大小、腫瘤組織類型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 NSCLC癌組織中miR-4286與AEG-1表達(dá)的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，miR-4286的表達(dá)與 AEG-1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.223，P=0.008），見(jiàn)表2。

表1 NSCLC癌組織中m i R-4286和AEG-1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系（例）

表2 140例NSCLC癌組織中m i R-4286與AEG-1表達(dá)的關(guān)系（例）

3 討論

miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，可通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控作用，參與多種生物學(xué)行為，如細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、分化、器官發(fā)育等，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-4]。最近有研究報(bào)道，miRNA也可通過(guò)與目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域序列結(jié)合抑制阻遏子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)上調(diào)[6]。本研究中，筆者通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)miR-4286與AEG-1基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合，并在NSCLC癌組織中觀察到miR-4286與AEG-1的表達(dá)一致升高，通過(guò)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)NSCLC癌組織中miR-4286與AEG-1的表達(dá)呈正相關(guān)。

miR-4286是一個(gè)在人胚胎干細(xì)胞早期分化進(jìn)程中篩選出的新發(fā)現(xiàn)的miRNA，在黑色素瘤、食管癌及直腸癌中可觀察到miR-4286表達(dá)的上調(diào)[7-10]。本研究中，筆者采用原位雜交方法檢測(cè)NSCLC組織中miR-4286的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-4286在NSCLC癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-4286的陽(yáng)性染色定位于NSCLC癌組織、癌旁正常組織的胞質(zhì)或細(xì)胞核，染色呈紅色至深紫色。此外，miR-4286在NSCLC癌組織中的高表達(dá)與患者腫瘤直徑大小、腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。以上結(jié)果表明miR-4286在NSCLC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

為研究NSCLC組織中miR-4286的表達(dá)上升是否與AEG-1的表達(dá)相關(guān)，筆者采用了免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了相應(yīng)組織芯片中AEG-1的蛋白表達(dá)。AEG-1是一個(gè)在HIV-I感染或TNF-α誘導(dǎo)的人胚胎星形細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因，其高表達(dá)被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[11-12]。本研究中，AEG-1在NSCLC癌組織中的高表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，且其高表達(dá)與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，該結(jié)果與筆者先前的報(bào)道相符[5]。此外，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示NSCLC癌組織中miR-4286的表達(dá)與AEG-1的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者高表達(dá)共同參與了NSCLC的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-4286與AEG-1在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并協(xié)同參與了NSCLC的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等進(jìn)程，抑制miR-4286或AEG-1的表達(dá)可望成為NSCLC靶向治療的新途徑。