HPV聯(lián)合MNNG對Het-1A細胞惡性轉化的影響

馬 月，鄭雨虹，趙 超，劉 冉，浦躍樸，尹立紅*

（東南大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009）

食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素作用、多基因參與、多階段發(fā)展的復雜性過程[1-2]。1982年Syrj?nen在食管癌組織中觀察到類似人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染的特征性改變，首次提出了食管癌可能與HPV感染有關的可能性[3]。在認識其復雜病因的過程中，越來越多證據(jù)表明HPV感染與食管癌的發(fā)生發(fā)展相關，但是HPV在細胞轉化的過程中發(fā)揮著誘導細胞永生化的作用，作為獨立因素致癌的證據(jù)不足，HPV更有可能在食管癌發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著協(xié)同和促進作用。環(huán)境流行病學研究表明亞硝胺類化合物能夠導致人胃癌、食管癌等多種腫瘤發(fā)生，N-甲 基 -N′-硝 基 -N-亞 硝 基 胍 (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)是一種N-亞硝基化合物，動物實驗表明其可誘發(fā)胃癌、食管癌、結直腸癌等。本課題組前期研究結果顯示，淮安食管癌高發(fā)區(qū)食管癌的發(fā)生與HPV感染具有一定關聯(lián)，而高發(fā)區(qū)飲用水檢測中也發(fā)現(xiàn)亞硝胺類物質暴露水平較高。因此，本研究通過慢病毒轉染使正常人食管上皮細胞Het-1A穩(wěn)定表達高危型HPV-18，聯(lián)合MNNG染毒構建細胞惡性轉化模型，探討HPV對細胞惡性轉化過程的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人正常食管上皮細胞Het-1A，由東南大學環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室提供。課題組前期完成慢病毒介導HPV全長基因轉染，通過嘌呤霉素篩選得到陽性克隆，擴增培養(yǎng)后，用熒光定量PCR檢測HPV DNA的表達，獲取穩(wěn)定攜帶HPV基因組DNA的Het-1A細胞。主要試劑包括：胎牛血清(Genial)，RPMI-1640(南京源之信生物技術有限公司)，胰蛋白酶和青-鏈霉素混合液(南京生興生物技術有限公司)，CCK-8細胞活力檢測試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司)，細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，BD Matrigel基質膠(Corning)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基采用PRIM-1640(含10%胎牛血清)，MNNG染毒劑量2 μmol/L。細胞分組如下：對照組，轉染空載體病毒的Het-1A細胞，常規(guī)培養(yǎng)；HPV-18單獨處理組(HPV)，HPV-18-Het-1A穩(wěn)定轉染株細胞，常規(guī)培養(yǎng)；MNNG單獨處理組(MNNG)，轉染空載體病毒的Het-1A細胞用2 μmol/L MNNG染毒，每代1次，染毒24 h；MNNG與HPV聯(lián)合處理組(HPV+MNNG)，HPV-18-Het-1A穩(wěn)定轉染株細胞用2 μmol/L MNNG染毒，每代1次，染毒24 h。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察 觀察細胞在持續(xù)慢性染毒過程中4組細胞的形態(tài)變化，對比染毒初期(第10代)及末期35代細胞形態(tài)，并拍照保存。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖 選取第10代、20代及35代細胞，各組細胞胰酶消化離心，收集對數(shù)生長期細胞，以每孔1萬個細胞接種于96孔板，每組設5個平行孔，24 h后按照CCK-8試劑盒說明書每100 μL完全培養(yǎng)基加10 μL CCK-8試劑，于CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃培養(yǎng)箱中作用2 h后，用酶標儀測定吸光度D(450)值。以對照組為基礎，計算實驗組細胞增殖率。

1.2.4 細胞周期檢測 各組細胞胰酶消化離心收集后吹打成單細胞懸液加70%乙醇1 mL，4 ℃固定過夜，加200 μL RNase A于37 ℃孵育30 min以去除RNA，上機前加入500 μL PI染色液混勻后，4 ℃避光染色30 min，采用流式細胞儀檢測。用增殖指數(shù)[(S+G2)/(G1+S+G2)×100%]表示細胞的增殖狀況。

1.2.5 Annexin V-APC/PI雙染法檢測細胞凋亡 用不含EDTA胰酶消化4組細胞，各收集3×105個細胞，PBS 洗滌。300 μL結合緩沖液重懸細胞后，分別加入3 μL Annexin V-APC和3 μL PI標記，室溫避光反應，1 h內上流式細胞儀檢測。

1.2.6 檢測細胞侵襲能力 將基質膠溶解到RPMI-1640 培養(yǎng)基后均勻平鋪transwell小室置4 ℃冰箱過夜。將各組細胞制成單細胞懸液，按每孔5×105接種于小室上層，小室下層中加入含20% FBS的培養(yǎng)基，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱孵育27 h 后清洗小室，甲醇固定，結晶紫染色，洗凈晾干，鏡下拍照計數(shù)。

1.2.7 檢測細胞遷移能力 將各組細胞制成單細胞懸液，按每孔2×105個細胞接種于Transwell上層小室，小室下層中加入含20% FBS的培養(yǎng)基，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中孵育27 h，清洗小室，甲醇固定，結晶紫染色，洗凈晾干，鏡下拍照計數(shù)。

1.2.8 軟瓊脂集落形成試驗 1.4%低熔點瓊脂糖與2×培養(yǎng)基以1∶1的體積等比例混合，制備下層膠置于4 ℃待凝。取4組細胞，胰酶消化離心，接種細胞密度為100/cm2。0.7%低熔點瓊脂糖與2×培養(yǎng)基以1∶1的體積等比例混合，制備上層瓊脂。1 mL上層瓊脂和細胞懸液充分混勻，加入10 cm皿中。37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周。倒置顯微鏡下觀察集落的大小，并拍照保存。按下式計算集落形成率，實驗重復3次。

集落形成率=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%

1.2.9 裸鼠成瘤試驗 選取4~6周齡裸鼠20只，隨機分成4組，每組5只。結合細胞功能實驗結果及惡性轉化相關指標，將第35代的4組細胞消化后重懸成單細胞懸液，調整濃度為5×107/mL，取0.2 mL接種在裸鼠右側腋下。觀察裸鼠的成瘤情況，并用游標卡尺進行測量，記錄長徑和短徑，按公式(體積=1/2長徑×短徑2)計算腫瘤體積。最后對腫瘤組織進行病理學檢查。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0軟件對結果進行統(tǒng)計分析。采用方差分析進行比較，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)

隨著染毒代數(shù)的增加，HPV+MNNG組和MNNG組細胞形態(tài)變化明顯，由原來體積較小的圓形鋪路石樣緊密貼合的生長情況轉變?yōu)轶w積增大，出現(xiàn)偽足、拉絲的不規(guī)則松散狀態(tài)，出現(xiàn)了類間質性轉化樣改變。與HPV組和對照組有明顯差異。細胞形態(tài)改變如圖1所示。各組細胞不同代的改變說明MNNG暴露促進了細胞形態(tài)的改變，HPV+MNNG聯(lián)合作用組與MNNG單獨作用組有相同的變化趨勢，且形態(tài)改變更明顯。

圖1 各組細胞形態(tài)變化(×100)

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力

第10代，染毒初期MNNG單獨染毒組、HPV轉染組及HPV+MNNG聯(lián)合作用組細胞增殖率較對照組均升高(P<0.05)；第20代聯(lián)合作用組、單獨MNNG染毒組和HPV轉染組增殖抑制率分別為(31.21±2.00)%、(20.10±2.14)%、(22.63±2.17)%，增殖活力較對照組(0)均降低(P<0.05)；隨著染毒代數(shù)的增加，第35代MNNG單獨染毒組、HPV組及HPV+MNNG聯(lián)合作用組細胞增殖率較對照組(0)明顯增強(P<0.05)，且聯(lián)合作用組細胞增殖率[(23.32±2.76)%]高于MNNG染毒組[(12.88±1.93)%] (P<0.05)。MNNG作用下細胞的增殖活力經歷了先升高后下降再升高的過程，在染毒第20和35代時HPV+ MNNG組在MNNG的毒性作用下增殖率改變較MNNG組更明顯，說明在HPV的作用下，細胞對毒物的敏感程度提高，且在染毒35代時，聯(lián)合組保持4組最高水平，提示HPV+MNNG聯(lián)合作用下促進了細胞的增殖活力，如圖2所示。

圖2 不同代數(shù)各組細胞增殖率

2.3 流式細胞術檢測細胞周期

各代細胞周期分布如圖3所示。染毒初期(第10代)，細胞受到毒作用刺激處于應激階段，HPV+MNNG組與MNNG組較對照組S期和G2期均增加(P<0.05)，且增殖指數(shù)HPV+MNNG組[(64.44±0.27)%]明顯高于MNNG組[(61.35±0.03)%](P<0.05)。隨著毒作用的累積，到染毒第20代，染毒組細胞周期發(fā)生了阻滯，HPV+MNNG和MNNG組細胞周期分別阻滯在G2期和S期，聯(lián)合作用組增殖指數(shù)最低[(62.58±0.17)%]，顯著低于其他各組(P<0.05)。至染毒第35代，染毒組隨著細胞自我修復的進行，細胞周期分布發(fā)生了變化，4組細胞增殖指數(shù)由高到低依次是HPV+MNNG組[(69.19±0.02)%]、MNNG組 [(64.92±0.05)%]、 HPV組 [(58.54±0.06) %]和對照組[(60.48±0.05)%]，聯(lián)合作用組與對照組相比，G1期降低(P<0.05)，S期與G2期均增高(P<0.05)，說明此階段，HPV+MNNG聯(lián)合作用及MNNG單獨作用均對細胞的增殖起促進作用，且聯(lián)合作用下細胞的增殖活性最強。此結果提示，HPV可能通過對細胞的周期調控，促進DNA的合成及有絲分裂，促進細胞的增殖，從而促進惡性轉化的發(fā)生與發(fā)展。

圖3 不同代各組細胞周期分布

2.4 細胞凋亡

MNNG和HPV作用于正常上皮細胞后，細胞凋亡率隨著染毒的代數(shù)增加發(fā)生了明顯變化。染毒初期(第10代)，MNNG組總凋亡率高于其他各組(P<0.05)，如表1所示。隨著毒作用累積，第20代HPV+MNNG、MNNG組凋亡率均高于HPV和對照組(P<0.05)，如表2所示。染毒至第35代，HPV+MNNG組、HPV組早期凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4組的總凋亡率由高到低依次為MNNG、HPV+MNNG、HPV和對照組，如表3所示。MNNG組的總凋亡率高于HPV+MNNG組(P<0.05)，并且高于HPV組與對照組(P<0.05)，說明MNNG+HPV聯(lián)合作用下，相比于MNNG單獨作用的細胞凋亡減少。結果表明，HPV作為生物因素對細胞產生的影響是個復雜的過程，在細胞的惡性轉化過程中可能存在不同于單一化學物質的調控途徑，HPV與MNNG的聯(lián)合減少了MNNG單獨作用下細胞的凋亡率，同時也說明HPV促進了細胞的增殖，在某種程度上加速了惡性轉化的進程。

表1 第10代各組細胞凋亡率(%，

表1 第10代各組細胞凋亡率(%，

與對照組相比，**P<0.01；與聯(lián)合作用組比較，# #P<0.01.

總凋亡率12.23±0.94**25.57±0.93##13.10±1.2011.16±0.50

表2 第20代各組細胞凋亡率(%，

表2 第20代各組細胞凋亡率(%，

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01.

總凋亡率**10.80±0.21**10.86±0.076.83±0.19對照組2.57±0.09 5.87±0.38 8.43±0.30

2.5 細胞侵襲與遷移

細胞的侵襲遷移能力是反映細胞惡性轉化的重要指標。染毒初期(第10代)，4組細胞侵襲試驗穿膜數(shù)均較少，染毒至第20代，穿膜數(shù)均增多，但組間差異均不明顯(P>0.05)。如圖4和圖5所示。細胞染毒至35代，侵襲結果顯示，HPV+MNNG聯(lián)合作用組穿膜細胞數(shù)(353.4±0.2)明顯高于MNNG組(220.7±0.0)(P<0.01)， 而MNNG組與HPV作用組(220.2±0.2)差異不大(P> 0.05)，對照組穿膜數(shù)最少(162.4±0.7)。細胞遷移試驗顯示，4組細胞穿膜數(shù)均有顯著性差異，細胞遷移能力由強到弱依次是HPV+MNNG、HPV、MNNG和對照組(各組細胞穿膜數(shù)依次為268.1±0.4、113.3±0.3、111.6±0.5、101.1±0.2)。聯(lián)合作用組的遷移能力與MNNG組有顯著性差異(P<0.01)，遷移試驗結果如圖6和圖7所示。結果顯示，結合細胞侵襲遷移能力與細胞的形態(tài)改變，HPV+MNNG聯(lián)合作用可能促進了上皮間質性轉化，后者在腫瘤形成和侵襲轉移中起著重要作用，是引發(fā)惡性腫瘤的關鍵因素，提示HPV在腫瘤形成的過程中可能發(fā)揮著重要的作用。

表3 第35代各組細胞凋亡率(%，

表3 第35代各組細胞凋亡率(%，

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與MNNG單獨作用組比較，#P<0.05，##P<0.01.

對照組4.53±0.22 8.70±0.12 13.23±0.16

2.6 軟瓊脂集落形成試驗

圖4 各組第10、20、35代細胞侵襲試驗結果(×200)

圖5 不同代數(shù)的各組細胞侵襲能力變化

各組細胞在第10代及20代時無集落形成，HPV與MNNG聯(lián)合作用組細胞在染毒第30代在軟瓊脂上可見較小集落(每個集落細胞數(shù)<50個)。至第35代，HPV+MNNG組可形成明顯集落，集落形態(tài)典型，如圖8所示。且HPV+MNNG、MNNG、HPV組集落形成率分別為(30.8±0.2)%、(27.1±0.3)%、(18.6±0.1)%，對照組集落形成數(shù)量較少，集落較小，且HPV+MNNG組在軟瓊脂的集落形成率明顯高于其他各組(P<0.05)，如圖9。顯示HPV+MNNG聯(lián)合作用誘導的細胞具有非錨定獨立性生長能力，具有惡性轉化的表征。

2.7 裸鼠成瘤實驗及病理組織學檢查

圖6 第35代各組細胞遷移試驗結果(×200)

實驗過程中裸鼠生存狀態(tài)良好，未出現(xiàn)不良反應。將第35代各組細胞接種于裸鼠，HPV組、對照組未成瘤，HPV+MNNG組與MNNG組接種2 d后注射局部均出可觸及腫物，瘤體逐漸增大，兩周左右兩組瘤體平均直徑分別達6.6和6.9 mm，兩周后各組瘤體體積不再有增大的趨勢。HPV+MNNG與MNNG組成瘤率均為100%，且兩組瘤體大小無顯著差異(P>0.05)。瘤體血供較為豐富，切面光滑平整。瘤體HE染色均發(fā)現(xiàn)類似腫瘤樣特征，細胞結構散亂，排列不規(guī)則，核大深染，如圖10。結果提示聯(lián)合作用組與MNNG單獨作用組細胞發(fā)生了惡性轉化，具備裸鼠體內致瘤能力。

3 討 論

人乳頭狀瘤病毒(HPV)是一類嗜鱗狀上皮環(huán)狀DNA病毒，可引起增生性病變[4-5]、乳頭瘤、鱗狀細胞疣狀病變[6-8]。HPV的傳播與周圍環(huán)境的直接或者間接接觸都可能有關，如空氣、土壤、食物、衣物等，除此之外人與人之間的皮膚接觸等也是HPV的主要傳播方式。研究已經證實，特定類型的高危型HPV 在宮頸的感染是導致宮頸癌的主要原因，此外HPV在口腔癌的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[3]。 Zou等[9]運用PCR方法檢測HPV得出高危型HPV的感染顯著提高了食管癌發(fā)病風險的結論；Cao等[10]通過免疫組化和原位雜交檢測食管癌組織中HPV感染情況，發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中HPV感染率顯著高于正常對照。有分子流行病學研究[11]發(fā)現(xiàn)50%~80%食管癌組織均有HPV不同亞型的感染，其中HPV-16/18型占60%左右，80%的腫瘤細胞發(fā)現(xiàn)有HPV DNA整合入宿主細胞DNA。越來越多的研究表明HPV感染在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。

圖7 不同代數(shù)各組細胞遷移能力的變化

高危型HPV E6蛋白和多種蛋白相互作用，其中p53與細胞周期凋亡等功能緊密相關，E6蛋白與抑癌蛋白p53作用可將p53蛋白通過泛素蛋白酶體途徑降 解[12-13]，使DNA損傷的細胞不能正常修復也不會發(fā)生凋亡，損傷累積增加最終可能導致正常細胞的惡性轉化[14-15]，E6蛋白還能改變端粒酶活性。端粒酶是一種使染色體穩(wěn)定并能增加分裂增殖能力的一類酶，正常情況下隨著分裂增加，端粒變短，細胞最終喪失分裂能力[16-18]。同樣被廣泛研究的E7蛋白，能與細胞周期中G1/S階段發(fā)揮重要作用的Rb家族蛋白結合并通過泛素-26S蛋白酶體途徑將其降解[19]。E7蛋白能夠下調p21蛋白及p27蛋白的表達，他們均是Rb蛋白通路中對細胞周期調控發(fā)揮重要作用的蛋白，同時，p21與抑癌作用密切相關，p27同樣可通過影響細胞周期使細胞過度增生，進而誘導腫瘤的發(fā)生[14-20]。除此之外，E6、E7作為主要癌蛋白與細胞的凋亡、免疫調節(jié)、細胞黏附、增殖等緊密相關。本實驗中高危型HPV的穩(wěn)定表達對細胞的增殖、周期等多種功能產生影響。

圖8 第35代各組細胞軟瓊脂集落形成試驗結果(×100)

圖9 第35代各組細胞集落形成率

圖10 裸鼠成瘤實驗的大體與病理觀察

本實驗中食管正常上皮細胞Het-1A在慢性MNNG 染毒過程中，HPV聯(lián)合MNNG發(fā)揮的作用在毒性刺激過程中比單因素作用更為敏感，二者在染毒初期增殖活性增高，可能是輕微毒作用下的應激反應。隨著毒作用累積，MNNG對細胞生長出現(xiàn)抑制效應，HPV與MNNG聯(lián)合作用組對細胞增殖周期抑制的程度高于單因素作用組。MNNG作為直接致癌物，能直接損傷DNA誘發(fā)癌變。細胞受到毒性累積作用之后引起DNA 損傷，并不斷進行損傷后的自我修復，在反復損傷與修復的過程中，細胞的高分裂速度導致DNA復制的穩(wěn)定性降低，一旦發(fā)生錯誤修復，并且固定下來會引起不可逆的改變，標志著DNA發(fā)生突變。隨著DNA損傷修復的進行，實驗中聯(lián)合作用組細胞的增殖活力高于單獨作用組，在4組中處于最高水平，MNNG單獨作用組次之。隨著染毒代數(shù)的增加，HPV與MNNG聯(lián)合作用組的總凋亡率低于MNNG單獨作用組，而HPV單獨作用組總凋亡率高于空載體對照組，聯(lián)合作用下，HPV在染毒過程中對細胞的凋亡發(fā)揮著一定的抑制作用，而HPV單因素處理下，促進了細胞的凋亡。相比于MNNG單獨作用，HPV與MNNG聯(lián)合作用使Het-1A細胞更早出現(xiàn)了促進增殖及抗凋亡的功能表現(xiàn)，HPV可能在致Het-1A細胞的惡性轉化中發(fā)揮著協(xié)同與促進作用。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，經常伴隨上皮細胞間質性轉化的發(fā)生，食管癌作為具有侵襲遷移特性的惡性腫瘤，在其發(fā)生發(fā)展過程中，越來越多的研究證實EMT在其中扮演重要的角色。在腫瘤發(fā)生過程中，正常上皮細胞發(fā)生EMT，進而發(fā)生原位癌，腫瘤細胞可通過EMT形成局部擴散。研究證實，肝癌、結腸癌、宮頸癌，乳腺癌等多種腫瘤侵襲轉移的過程中存在EMT的發(fā)生，其嚴重程度與EMT相關[12]，為改善惡性腫瘤的預后，EMT在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的機制研究成為熱點。本實驗中HPV與MNNG聯(lián)合作用組、MNNG單獨作用組形態(tài)隨著染毒次數(shù)的增加發(fā)生明顯變化，細胞失去規(guī)則的形狀，變細變長，出現(xiàn)偽足，有類似上皮間質轉化的表征。此外，細胞的侵襲遷移試驗結果顯示，HPV與MNNG聯(lián)合作用的穿膜細胞數(shù)均明顯高于MNNG單獨作用組，染毒組細胞穿膜數(shù)明顯高于對照組。HPV與MNNG聯(lián)合作用具備更強的侵襲和遷移能力，提示HPV在這個過程中可能促進了上皮間質性轉化，從而促進惡性轉化的進程，同時為后續(xù)研究提供了思路。

HPV與MNNG聯(lián)合作用和MNNG單獨作用相比，雖然裸鼠成瘤試驗中瘤體大小及生長速度差異不大，但是在惡性轉化的過程當中，聯(lián)合作用組的軟瓊脂非錨定獨立生長能力明顯高于MNNG單獨作用組。聯(lián)合作用組在染毒30代時就已經可以形成較小集落，而MNNG單獨作用組并無集落形成；染毒至35代，MNNG單獨作用組可形成陽性集落，而HPV與MNNG聯(lián)合作用下形成的陽性集落更多且更大，說明HPV促進了細胞的非錨定獨立生長能力，使細胞更早的具備惡性表征。

綜上所述，在Het-1A細胞惡性轉化過程中，HPV與MNNG聯(lián)合作用顯示出細胞增殖能力、抗凋亡能力、侵襲遷移能力及非錨定獨立生長能力均強于MNNG單獨作用組的毒性作用特征，更早的具備了惡性轉化的表征。HPV聯(lián)合MNNG致Het-1A細胞惡性轉化模型的成功構建說明，HPV在細胞惡性轉化的過程中發(fā)揮著促進與協(xié)同的作用，加快了細胞惡性轉化的進程。