氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定人體尿液中16種鄰苯二甲酸酯

張 力，雍 毅，黃 祥，侯 江，胡 穎，羅 利，吳 怡

(1. 四川省環(huán)境保護科學(xué)研究院，四川 成都 610041; 2. 四川省環(huán)境保護重金屬污染防治重點實驗室，四川 成都 610041;3. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610041)

0 引 言

鄰苯二甲酸酯（phthalate acid esters, PAEs），又稱酞酯、酞酸酯，常作為增塑劑和軟化劑應(yīng)用到塑料工業(yè)，效果顯著而成本低廉[1]。同時，它也是一種環(huán)境激素類內(nèi)分泌干擾化合物（endocrine disrupting chemical, EDC）[2]，會導(dǎo)致人體生殖功能障礙、發(fā)育行為障礙及其他與雌激素調(diào)解失衡的有關(guān)病癥[3-4]。

塑料是目前最通用、最受歡迎的材料，被各行各業(yè)廣泛的使用，極大便利了人們生活。但是，由于鄰苯二甲酸酯在材料中并沒有與材料以共價鍵結(jié)合，含鄰苯二甲酸酯的材料在生產(chǎn)、使用過程中和棄置后，鄰苯二甲酸酯均會源源不斷地釋放到周圍環(huán)境中，并通過生物富集作用、體表接觸和呼吸進入人體，從而影響人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，成為人們潛在的健康隱患[5]。歐洲化學(xué)品管理署（ECHA）2010年公布的第1份REACH法規(guī)“高關(guān)注物質(zhì)名單”中共有16種高關(guān)注物質(zhì)，其中有BBP、DBP和DIBP 3種鄰苯二甲酸酯類增塑劑[6]。美國則早在1977年就將6種鄰苯二甲酸酯類化合物列入重點控制污染物名單[7]。

本方法采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合液液萃取和高速離心分離的前處理方法，對某醫(yī)院采集的人尿中的16種鄰苯二甲酸酯進行了定量分析，為更精確、全面地評價鄰苯二甲酸酯在人體中的內(nèi)暴露程度提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

1.1.1 實驗試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：16種鄰苯二甲酸酯混標(biāo)（美國AccuStandard），純度不低于99.9%。色譜純正己烷購自德國CNW公司。

1.1.2 實驗儀器

美國 Thermo Fisher Scientific 公司 TRACE1310氣相色譜+ITQ700質(zhì)譜聯(lián)用儀，帶AI/AS1310自動進樣器；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；N-EVAP-112氮吹儀（美國Organomation Associates）

1.2 樣品的預(yù)處理方法

本實驗采用液液萃取的方法對尿液樣品進行前處理。移取尿液4 mL于離心管中，加入0.4 g氯化鈉混勻，分別用1 mL正己烷提取3次，離心機4 000 r/min 離心 10 min，收集并合并正己烷層，用0.22 μm有機系PTFE濾頭過濾，40 ℃下氮吹至半干，正己烷定容至1 mL，進行GC-MS分析。

1.3 GC-MS測定條件

1.3.1 GC-MS 色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度 60 ℃，保持1 min，以 20 ℃/min 升溫至 220 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min 升溫至 280 ℃，保持 4 min；載氣：氦氣（純度≥99.999%）流量 1 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL。

1.3.2 GC-MS 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：250 ℃；色譜與質(zhì)譜接口溫度：280 ℃；溶劑延遲：5 min；檢測方式：選擇離子掃描模式（SIM），監(jiān)測離子見表1；外標(biāo)法定量，用保留時間及特征離子定性、定量分析。

表1 16種鄰苯二甲酸酯的保留時間、定性離子及定量離子

2 結(jié)果與分析

2.1 16種鄰苯二甲酸酯的GC-MS分析

本方法使用HP-5MS毛細管柱，進樣溶劑為正己烷，進樣量不能大于2 μL，過大的進樣量會導(dǎo)致溶劑效應(yīng)或使色譜柱過載，降低檢測效果，進樣量過小，方法靈敏度則達不到方法要求，故選擇1 μL為本方法進樣量；鄰苯二甲酸酯沸點較高，故進樣口溫度設(shè)置為250 ℃，使樣品在襯管中完全汽化，柱溫箱最高溫度和接口溫度設(shè)置為280 ℃，以保證色譜柱和接口潔凈無殘留。方法優(yōu)化了氣相色譜柱溫箱升溫程序，降低了220～280 ℃的升溫速率，使性質(zhì)相似、保留時間相近的峰分離良好。此色譜柱最佳載氣流量為1～2 mL/min，較低的流量可以增加峰分離度，故將載氣流量設(shè)置為1 mL/min。

為了提高檢測靈敏度和重現(xiàn)性[8-10]，避免樣品中其他組分的干擾，本方法采用選擇離子檢測的模式（SIM）。在選擇離子檢測模式下，質(zhì)譜檢測器只檢測選定的特征離子，與全掃描模式相比，在相同的掃描模式周期內(nèi)，選擇離子模式檢測每個離子的時間更多，檢測靈敏度提高了5～100倍[2]。使用16種鄰苯二甲酸酯混標(biāo)在1.3條件下進行實驗，得到選擇離子模式（SIM）色譜圖，見圖1；16種鄰苯二甲酸酯的保留時間、定性離子及定量離子見表1。

圖1 16種鄰苯二甲酸酯的選擇離子檢測模式（SIM）色譜圖

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

PAEs是親脂性有機物，其辛醇-水分配系數(shù)較高，水溶性低，易溶于正己烷、二氯甲烷等大部分有機溶劑[11-12]。方法比較了正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯3種有機溶劑作為提取溶劑對PAEs的提取效率。結(jié)果表明，3種提取溶劑對水中PAEs的提取效果相近；3種溶劑中，正己烷非極性最強，萃取的雜質(zhì)最少，同時，二氯甲烷毒性較強，乙酸乙酯揮發(fā)性較弱，而正己烷兼具低毒、易揮發(fā)的優(yōu)點，故選擇正己烷作為樣品的提取溶劑。固相萃取等常用凈化手段凈化過程中萃取柱體、容器等的PAEs污染難以消除。同時，人體尿液樣品采集不易單個樣品體積小，輕微的污染將帶來巨大的誤差，故方法未對提取液進行凈化。

2.3 方法線性范圍、檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）

采用外標(biāo)法對樣品進行定量分析，將16種鄰苯二甲酸酯混標(biāo)母液用正己烷梯度稀釋成濃度為0.05，0.1，0.5，1，2，4 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別以各組分特征定量離子的峰面積Y對相應(yīng)質(zhì)量濃度X作線性回歸，得出線性方程及相關(guān)系數(shù)。從結(jié)果可以看出，16種鄰苯二甲酸酯在0.05～4 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2≥0.99。以3倍信噪比（S/N）確定方法檢出限（LOD）為 0.001～0.017 mg/L，10 倍信噪比（S/N）為定量下限（LOQ）0.002～0.056 mg/L，詳見表2。

2.4 實驗空白

鄰苯二甲酸酯廣泛存在于塑料制品和包括實驗室在內(nèi)的各種環(huán)境中，故實驗中用到的所有器具均為玻璃制品，使用前將器具用正己烷潤洗，在通風(fēng)廚晾干，以保證器具干凈。使用后實驗器具均用肥皂水擦洗，并在30 ℃下超聲10 min，自來水洗凈，再用超純水淋洗后在烘箱中以100 ℃烘烤2 h，以降低空白值。以生理鹽水作為空白尿樣按本方法處理并檢測，空白尿樣在鄰苯二甲酸酯對應(yīng)保留時間處峰面積均小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點該物質(zhì)峰面積20%，DHXP定量離子m/z=149色譜圖如圖2所示。

2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度實驗

根據(jù)中國藥典（2015）通則9012《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》，采用分析方法的準(zhǔn)確度（重復(fù)性）描述該方法測得值與分析物標(biāo)示濃度的接近程度（一般用加標(biāo)回收率反映方法的準(zhǔn)確度），精密度為測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）。本文用同一份均勻人體尿液樣本分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作液配制高、低2個濃度級別的質(zhì)量控制樣品，每個濃度級別8份樣品，按照前文所述方法對原樣和加標(biāo)樣品進行檢測，得到加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3所示?？梢钥闯?，除DIBP外，加標(biāo)樣品8次測定的回收率在80%～120%之間，兩種濃度梯度下DIBP回收率均偏低，但高加標(biāo)量回收率更高，可能是因為樣品未經(jīng)過凈化，DIBP受到雜質(zhì)干擾，導(dǎo)致回收率偏低，提高加標(biāo)量時，進樣量和前處理程序一致，DIBP的量增加而雜質(zhì)的量并沒有明顯變化，回收率得到提高；除低濃度級別樣品DMP、DEP、DIBP和 DBP外，RSD均低于 10%，方法精密度和準(zhǔn)確度滿足分析要求。

表2 16種鄰苯二甲酸酯的方法線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、LOD和LOQ

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點和空白尿樣DHXP定量離子m/z=149色譜圖

2.6 實際樣品的測定

收集了90份成都市某醫(yī)院人尿樣品，利用試驗建立的方法對其進行測定，扣除空白值后，DIBP、DBP和DEHP等10種鄰苯二甲酸酯均有檢出，其中DBP和DIBP檢出率高達77%和50%，DEHP檢出率也達到22%。表明成都市采樣人群中主要暴露的污染物為DBP、DIBP、DEHP和DNP。采樣人群尿液樣品PAEs含量范圍和檢出率見表4。

3 結(jié)束語

本文采用正己烷提取、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)，建立了測定人尿中16種鄰苯二甲酸酯的分析方法。方法檢出限（LOD）為 0.001～0.017 mg/L，定量下限為 0.002～0.056 mg/L，除 DIBP 外，所有組分回收率在80%～120%之間；DMP、DEP、DIBP和DBP4種組分低濃度級別樣品RSD較高，其他組分高、低兩個濃度級別樣品RSD均小于10%。本方法前處理過程簡單方便、檢測靈敏度高、線性范圍寬，滿足人尿中鄰苯二甲酸酯的定性和定量檢測的需求，對鄰苯二甲酸酯在人體的內(nèi)暴露評價有一定參考意義。

表3 16種鄰苯二甲酸酯的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表4 成都市某醫(yī)院人尿樣品PAEs含量范圍和檢出率