• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    家雞鈉尿肽受體B基因的克隆和組織表達(dá)分析

    2018-12-06 10:59:04李正陽(yáng)張劍南陳軍安李娟王亞軍
    四川動(dòng)物 2018年6期
    關(guān)鍵詞:家雞生理功能垂體

    李正陽(yáng), 張劍南, 陳軍安, 李娟, 王亞軍

    (四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都610065)

    鈉尿肽家族(natriuretic peptide system,NPs)是一類重要多肽家族,可參與調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞、神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫和生長(zhǎng)等多種生理過(guò)程(Toop & Donald,2004),以及維持機(jī)體滲透穩(wěn)態(tài)和心血管穩(wěn)態(tài)。NPs由心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)和C-型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)3種結(jié)構(gòu)相關(guān)多肽組成(Martinez-Rumayoretal.,2008;Nobataetal.,2010)。ANP和BNP主要在心肌細(xì)胞中合成,分泌進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)揮作用;而CNP則作為旁分泌或自分泌因子合成于大腦或其他外周組織,且具有遠(yuǎn)弱于ANP和BNP的利尿利鈉作用(Takei,2000)。在哺乳動(dòng)物中,CNP的生理功能包括調(diào)節(jié)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)、促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化以及作用于血管平滑肌細(xì)胞發(fā)揮血管舒張作用等(Potteretal.,2006;Johnson & Olson,2008);此外,CNP可以作用于垂體細(xì)胞,促進(jìn)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cGMP)的積累,抑制促性腺激素釋放激素(GnRH)誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員,抑制促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)誘導(dǎo)的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)釋放等(Fowkesetal.,1999;Fowkesetal.,2000;Chatelainetal.,2003)。

    NPs的生理功能依賴其特異性鈉尿肽受體(natriuretic peptide receptors,NPRs)發(fā)揮效應(yīng)。在哺乳動(dòng)物中,NPRs可分為NPR-A、NPR-B和NPR-C 3種類型(Potteretal.,2006)。其中,不同于NPR-A(能夠結(jié)合ANP和BNP)和NPR-C(能夠結(jié)合3種類型的NPs),NPR-B只能選擇性地結(jié)合CNP,并介導(dǎo)其生理功能,如,CNP或NPR-B敲除型小鼠由于軟骨骨化功能受損,會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的侏儒癥表型(Chushoetal.,2001;Tamuraetal.,2004;Tsuji & Kunieda,2005)。NPR-B為單次跨膜受體,與NPR-A和NPR-C的氨基酸序列同源性分別為44%和30%,其N端的433個(gè)氨基酸位于細(xì)胞膜外,最初的22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。此外,N端還包含與CNP結(jié)合的重要位點(diǎn)Glu332以及參與形成3對(duì)二硫鍵的6個(gè)Cys殘基和7個(gè)N糖基化位點(diǎn)(Ogawaetal.,2004)。C末端的252個(gè)氨基酸為鳥苷酸環(huán)化酶區(qū)域,該區(qū)域被認(rèn)為具有鳥苷酸環(huán)化酶活性(Beavo & Brunton,2002),可以通過(guò)產(chǎn)生胞內(nèi)第二信使cGMP從而介導(dǎo)CNP的生理效應(yīng)(Pandey,2005;Sabbatinietal.,2005;Kobayashietal.,2012)。

    盡管在哺乳動(dòng)物中,NPR-B的結(jié)構(gòu)及其介導(dǎo)的生理功能已逐步明確,但在禽類中,有關(guān)NPR-B的研究幾屬空白。鑒于NPR-B介導(dǎo)的軟骨骨化和垂體激素釋放等生理功能與經(jīng)濟(jì)效益密切相關(guān),本研究選擇家雞Gallusgallusdomesticus為模型,首次從垂體組織中克隆得到了家雞NPR-B基因,確定其氨基酸序列,在此基礎(chǔ)上,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)首次探究NPR-B基因在成年家雞中的組織表達(dá)圖譜。本研究為探究家雞NPR-B的胞內(nèi)信號(hào)通路及其在家雞中介導(dǎo)的生理功能奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為羅曼粉成年家雞,購(gòu)自四川牧星養(yǎng)雞場(chǎng),共選取成年家雞6只(3雄3雌);真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購(gòu)自Invitrogen;引物合成、DNA測(cè)序工作由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成;RNAzol購(gòu)自Molecular Research Center;KOD FX高保真DNA聚合酶購(gòu)自TOYOBO;MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、Easy-Taq酶、限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa;分子克隆宿主大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備保存;PCR儀(S1000 Thermal Cycler)、熒光定量PCR儀(CFX96)、熒光染料Eva Green、96孔板、塑料封膜均購(gòu)自Bio-Rad。

    1.2 方法

    1.2.1總RNA提取取家雞組織,包括全腦、心臟、腎臟、肝臟、肌肉、卵巢、精巢、十二指腸、垂體、脾臟、脂肪、端腦、中腦、小腦、后腦和下丘腦等,迅速放入液氮并充分研磨成粉末。總RNA提取嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作:取約60 mg組織粉末與600 μL RNAzol混合;補(bǔ)充240 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)滅菌水,用渦旋儀混勻約15 s;4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min;取上清,加入3 μL阿司咪唑,渦旋15 s后于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min;取上清,加入等體積異丙醇,于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min;小心吸取上清并棄掉,加入75%乙醇漂洗總RNA沉淀,于4 ℃、8 000 r·min-1離心3 min;重復(fù)上一步,漂洗RNA沉淀;棄上清,用20 μL DEPC滅菌水溶解沉淀,及時(shí)構(gòu)建cDNA模板或-80 ℃保存。

    1.2.2引物設(shè)計(jì)利用NCBI預(yù)測(cè)的家雞NPR-B基因序列(GenBank登錄號(hào):XM_003642919)和家雞的野生祖先紅原雞Gallusgallus基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息(http://www.ensembl.org/Gallus_gallus),依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)克隆家雞NPR-B基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)克隆引物和用于組織表達(dá)分析的qPCR引物(表1)。

    表1 引物序列Table 1 Primer sequence

    注: 下劃線表示引物設(shè)計(jì)時(shí)添加的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)

    Note: Restriction sites added at the 5’-end of the primers are underlined

    1.2.3cDNA模板制備以各組織總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA模板。取2 μg總RNA樣品,與1 μL Oligo-dT混合;補(bǔ)DEPC滅菌水至總體積5 μL(Oligo-dT終濃度為0.5 μg·μL-1),混勻;于PCR儀中70 ℃反應(yīng)10 min后,立即取出放置于冰上10 min;加入2 μL5×RT buffer,0.5 μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶,0.5 μL dNTPs,補(bǔ)充DEPC滅菌水至總體積10 μL,混勻后于PCR儀中42 ℃反應(yīng)1.5 h,70 ℃反應(yīng)10 min結(jié)束;取反應(yīng)所得產(chǎn)物加入70 μL滅菌水,所得混合溶液即為cDNA模板。

    1.2.4載體構(gòu)建以家雞垂體組織cDNA為模板,使用引物對(duì)NPR-B基因的開放閱讀框(ORF)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:5 μL 2×KOD緩沖液,2 μL垂體組織cDNA模板,2 μL dNTPs,上、下游引物各0.1 μL,0.5 μL KOD-FX聚合酶,0.3 μL去離子滅菌水。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,62 ℃退火30 s,68 ℃延伸3 min,34個(gè)循環(huán);68 ℃延伸10 min。取3 μL反應(yīng)產(chǎn)物,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。利用DNA純化回收試劑盒回收PCR反應(yīng)液,使用EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)pcDNA3.1質(zhì)粒和純化回收產(chǎn)物進(jìn)行酶切,37 ℃過(guò)夜;純化回收酶切產(chǎn)物,使用T4DNA連接酶連接的pcDNA3.1和NPR-B片段;按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,再涂于含氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB培養(yǎng)基上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),挑選陽(yáng)性單克隆提取質(zhì)粒,送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

    1.2.5組織表達(dá)分析采用家雞不同組織的cDNA模板,3只公雞為雄性組,3只母雞為雌性組,以qPCR方法檢測(cè)NPR-B基因的表達(dá)水平,具體方法參考祝國(guó)強(qiáng)等(2017)和鄧秋洋等(2018)。PCR擴(kuò)增體系:0.4 μL二甲亞砜,2 μL 10×buffer,6 μL cDNA模板,0.4 μL dNTPs,上、下游引物各0.2 μL,1 μL熒光染料Eva Green,1 μL Easy-Taq酶,最后用去離子滅菌水補(bǔ)足總體積至20 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性20 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,39個(gè)循環(huán),按照0.5 ℃/5 s的速度從70 ℃到95 ℃向上升溫熔解,生成熔解曲線。熒光定量PCR的結(jié)果按照比較CT值法(2-ΔΔCT法)進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)處理。

    1.2.6生物信息學(xué)分析使用SnapGene、DNAStar和APE進(jìn)行序列分析和蛋白質(zhì)翻譯,IBS 1.0繪制基因結(jié)構(gòu)圖,BioEdit和DNAMAN進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)序列比對(duì),CFX Manager進(jìn)行qPCR數(shù)據(jù)定量分析;序列分析使用的在線數(shù)據(jù)庫(kù)包括GenBank(http://www.ncbi.nih.gov)、Ensembl(http://www.ensembl.org)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)。

    1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism7進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,相同組織在雄性組和雌性組之間的比較用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 家雞NPR-B基因的克隆與序列分析

    實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的NPR-B基因條帶(圖1)。將家雞NPR-B基因的測(cè)序結(jié)果與紅原雞基因組序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示:家雞NPR-B基因位于Z染色體上,包含22個(gè)外顯子(圖2),編碼區(qū)cDNA全長(zhǎng)3 189 bp,編碼1 062個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào):MH271322)。家雞的NPR-B與人Homosapiens、大鼠Rattusnorvegicus、非洲爪蟾Xenopuslaevis和斑馬魚Daniorerio相比,氨基酸序列一致性分別達(dá)到了79%、78%、73%和67%。胞內(nèi)區(qū)(intracellular domain,ICD)存在高度保守的結(jié)構(gòu)域,包括無(wú)激酶活性的激酶同源區(qū)(kinase homology domain,KHD)和鳥苷酸環(huán)化酶區(qū)(guanylyl cyclase domain,GCD),且KHD中存在NPR-A和NPR-B均具有的保守的ATP結(jié)合元件Gly-X-X-X-Gly序列(圖3)。

    圖1 家雞NPR-B基因擴(kuò)增
    Fig. 1 PCR amplification ofNPR-Bgene fromGallusgallusdomesticus

    圖2 家雞NPR-B基因結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structure of NPR-B gene from Gallus gallus domesticus

    方框代表外顯子, 黑色陰影部分代表編碼區(qū)

    Boxes indicate exons, black shaded parts indicate the coding regions

    圖3 家雞NPR-B的氨基酸序列與人、大鼠、非洲爪蟾和斑馬魚比對(duì)Fig. 3 Amino acid sequence alignment of Gallus gallus domesticus NPR-B with that of Homo sapiens, Rattus norvegicus, Xenopus laevis and Danio rerio

    方框內(nèi)部分為激酶同源區(qū), 陰影部分為ATP結(jié)合位點(diǎn)和鳥苷酸環(huán)化酶區(qū)

    Boxes indicate the kinase homology domain, shaded areas are ATP binding site and the guanylyl cyclase domain

    2.2 家雞NPR-B基因mRNA組織表達(dá)分析

    在外周組織中,NPR-B基因高表達(dá)于心臟、肌肉、腎臟和垂體,而在精巢、十二指腸的表達(dá)量相對(duì)較低,在脂肪、脾臟檢測(cè)到微弱的表達(dá)信號(hào);在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,NPR-B基因高表達(dá)于中腦,在其他腦功能區(qū)的表達(dá)水平較低。

    NPR-B基因位于家雞Z染色體上,因此,基因組中雄、雌性的NPR-B基因拷貝數(shù)比例為2∶1。比較不同性別組中NPR-B基因的組織表達(dá)情況(圖4:A),結(jié)果顯示,雄性個(gè)體NPR-B基因在端腦和小腦中具有更高的表達(dá)水平,而雌性個(gè)體NPR-B基因在心臟、腎臟和垂體組織中具有更高的表達(dá)水平。

    NPR-B基因在垂體中具有較高的表達(dá)水平,檢測(cè)其在垂體頭部和尾部的表達(dá),結(jié)果顯示,NPR-B基因特異性高表達(dá)于垂體頭部(圖4:B)。

    圖4 家雞NPR-B基因組織表達(dá)Fig. 4 Expression of NPR-B gene in the tissues of Gallus gallus domesticus

    A. qPCR檢測(cè)NPR-B基因mRNA在家雞各組織中的表達(dá)(以β-actin基因作為內(nèi)參,n=3), Br. 全腦, He. 心臟, Ki. 腎臟, Li. 肝臟, Mu. 肌肉, Ov. 卵巢, Te. 精巢, Du. 十二指腸, Pi. 垂體, Sp. 脾臟, Fat. 脂肪, Tc. 端腦, Mb. 中腦, Cb. 小腦, Hb. 后腦, Hp. 下丘腦; B. qPCR檢測(cè)NPR-B基因在家雞垂體頭部(Ce)和尾部(Ca)的分布情況(以β-actin基因作為內(nèi)參,n=6);*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

    A. Expression ofNPR-Bgene in chicken tissues as determined by qPCR (the mRNA levels ofNPR-Bwere normalized to those ofβ-actin,n=3), Br. whole brain, He. heart, Ki. kidney, Li. liver, Mu. muscle, Ov. ovary, Te. testis, Du. duodenum, Pi. pituitary, Sp. spleen, Fat. fat, Tc. telencephalon, Mb. midbrain, Cb. cerebellum, Hb. hindbrain, Hp. hypothalamus; B. qPCR detection ofNPR-BmRNA distribution in cephalic lobe (Ce) and caudal lobe (Ca) of chicken pituitary (the mRNA levels ofNPR-Bwere normalized to those ofβ-actin,n=6);*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

    3 討論

    在哺乳動(dòng)物中,CNP作為旁分泌或自分泌因子,通過(guò)激活NPR-B參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能、血管張力、成骨細(xì)胞分裂分化以及軟骨骨化等功能(Potteretal.,2006),但其在禽類中的研究十分欠缺。本研究從家雞垂體組織中克隆得到NPR-B基因,并首次報(bào)道其序列和組織表達(dá)圖譜,研究結(jié)果為探究NPR-B受體及其配體CNP在家雞中的生理功能奠定基礎(chǔ)。

    家雞NPR-B基因的cDNA序列全長(zhǎng)3 189 bp,由22個(gè)外顯子組成,編碼具1 062個(gè)氨基酸的蛋白。氨基酸序列比對(duì)顯示,家雞NPR-B與人、大鼠、非洲爪蟾和斑馬魚均具有較高的序列一致性,尤其是ICD的氨基酸序列高度保守,該區(qū)域包含的位點(diǎn)有助于NPR-B二聚化及結(jié)合配體后的空間構(gòu)象改變。在受體激活后,ATP將結(jié)合到胞內(nèi)KHD上的ATP結(jié)合位點(diǎn),活化的KHD進(jìn)一步激活下方的鳥苷酸環(huán)化酶,從而催化胞內(nèi)cGMP的生成(Joubertetal.,2005),這預(yù)示著NPR-B在家雞中具有與哺乳動(dòng)物類似的信號(hào)通路。

    本研究利用qPCR解析NPR-B基因在家雞組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示,NPR-B基因在家雞心臟、腎臟、肌肉、中腦和垂體中有較高表達(dá)水平,在精巢、十二指腸中表達(dá)量相對(duì)較低。此外,雌、雄性個(gè)體相同組織間NPR-B基因的表達(dá)水平有差異,這種差異是否與NPR-B基因位于Z染色體有關(guān)有待后續(xù)研究。NPR-B基因在心臟中的高表達(dá)預(yù)示其可能參與CNP調(diào)節(jié)血管張力的生理功能(Toop & Donald,2004);其在腦和垂體中的高表達(dá)與大鼠中的研究結(jié)果高度一致(Langubetal.,1995),暗示NPR-B在腦和垂體中具有保守的生理功能。同時(shí),進(jìn)一步檢測(cè)了NPR-B基因在家雞垂體頭部和尾部的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)NPR-B基因特異性高表達(dá)于家雞垂體頭部區(qū)域,該區(qū)域垂體細(xì)胞主要分泌2種關(guān)鍵垂體激素:ACTH和催乳素。在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn),CNP在生理濃度下可以抑制由CRH引起的垂體ACTH釋放(Guild & Cramb,1999),結(jié)合NPR-B在家雞垂體頭部的特異性分布,本研究暗示家雞CNP/NPR-B系統(tǒng)可能參與調(diào)控家雞垂體激素(ACTH或催乳素)的釋放,進(jìn)而影響家雞應(yīng)激或繁殖,值得深入探究。

    猜你喜歡
    家雞生理功能垂體
    有趣的漢字:鳥
    侵襲性垂體腺瘤中l(wèi)ncRNA-mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
    RNA干擾技術(shù)的生理功能及其在豬病中的應(yīng)用
    家雞:野鳥到家禽
    植物精油的生理功能及其在飼料中的應(yīng)用
    廣東飼料(2016年4期)2016-12-01 03:43:17
    垂體后葉素在腹腔鏡下大子宮次全切除術(shù)中的應(yīng)用
    雞的視力越來(lái)越差都是人類造成的
    垂體腺瘤MRI技術(shù)的研究進(jìn)展
    磁共振成像(2015年9期)2015-12-26 07:20:34
    殼寡糖的制備方法,生理功能以及應(yīng)用趨勢(shì)
    河南科技(2014年7期)2014-02-27 14:11:10
    碳酸酐酶的生理功能、多樣性及其在CO2捕集中的應(yīng)用
    99久久综合免费| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人精品婷婷| 黑人猛操日本美女一级片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 在现免费观看毛片| 亚洲av不卡在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 国产av一区二区精品久久 | 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲伊人久久精品综合| 777米奇影视久久| 亚洲精品国产成人久久av| 青青草视频在线视频观看| 97热精品久久久久久| 亚洲人与动物交配视频| 一级av片app| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 赤兔流量卡办理| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 中文字幕av成人在线电影| 看十八女毛片水多多多| 一个人免费看片子| 美女中出高潮动态图| 91狼人影院| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美精品专区久久| 2022亚洲国产成人精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品三级大全| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 一级av片app| kizo精华| 边亲边吃奶的免费视频| 美女国产视频在线观看| av在线播放精品| 少妇熟女欧美另类| 美女中出高潮动态图| 全区人妻精品视频| 亚洲欧洲国产日韩| 视频中文字幕在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 国产 一区 欧美 日韩| 成人美女网站在线观看视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 不卡视频在线观看欧美| 国产在线视频一区二区| av天堂中文字幕网| 亚洲欧美日韩东京热| 18+在线观看网站| 香蕉精品网在线| 如何舔出高潮| 国产乱人偷精品视频| 另类亚洲欧美激情| 高清午夜精品一区二区三区| 午夜福利高清视频| av播播在线观看一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 日韩大片免费观看网站| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲精品久久午夜乱码| 性色avwww在线观看| 简卡轻食公司| 三级国产精品片| 韩国av在线不卡| 97在线人人人人妻| 亚洲性久久影院| 亚洲av二区三区四区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产精品久久久久久久久免| 日日啪夜夜爽| 黄色配什么色好看| 国产永久视频网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 高清日韩中文字幕在线| 搡老乐熟女国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 国产 一区 欧美 日韩| 在线 av 中文字幕| 一区二区av电影网| 亚洲国产av新网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 如何舔出高潮| 国产在线免费精品| 免费人成在线观看视频色| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品不卡视频一区二区| 成人免费观看视频高清| 人妻夜夜爽99麻豆av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 少妇丰满av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 五月伊人婷婷丁香| 色婷婷av一区二区三区视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产男人的电影天堂91| 激情五月婷婷亚洲| 日韩强制内射视频| 青青草视频在线视频观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99久久综合免费| 欧美3d第一页| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲第一av免费看| 久久国产精品大桥未久av | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久久久久久成人| 欧美+日韩+精品| 色综合色国产| 两个人的视频大全免费| 深夜a级毛片| 我的女老师完整版在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 午夜福利在线在线| 最黄视频免费看| 视频中文字幕在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 国产在线免费精品| 日韩av免费高清视频| 51国产日韩欧美| 亚洲国产精品999| 精华霜和精华液先用哪个| 午夜福利视频精品| 欧美97在线视频| 国产精品国产三级专区第一集| 色视频在线一区二区三区| 亚洲人成网站在线播| 精品国产露脸久久av麻豆| 一级毛片 在线播放| 老司机影院成人| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美bdsm另类| 精品一区二区三区视频在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久久久久久久大av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99国产精品免费福利视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 成人一区二区视频在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 我要看黄色一级片免费的| 久久久a久久爽久久v久久| 久久精品人妻少妇| 亚洲成人手机| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久久成人免费电影| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产极品天堂在线| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| av在线观看视频网站免费| 久久6这里有精品| av黄色大香蕉| 久久99精品国语久久久| 插阴视频在线观看视频| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人免费观看mmmm| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品.久久久| 黑人高潮一二区| 在线免费观看不下载黄p国产| 人妻一区二区av| 精品久久久久久久久亚洲| 久久久久久久精品精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 中文天堂在线官网| 中文欧美无线码| 少妇的逼好多水| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产淫片久久久久久久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 九草在线视频观看| 国产精品成人在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成人综合一区亚洲| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品午夜福利在线看| 在线 av 中文字幕| 亚洲av二区三区四区| 男女边吃奶边做爰视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 午夜福利高清视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品人妻久久久久久| 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品熟女久久久久浪| 国产伦在线观看视频一区| 中国三级夫妇交换| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一级毛片 在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久国产精品大桥未久av | 韩国av在线不卡| av天堂中文字幕网| 久久99热这里只频精品6学生| 黄色欧美视频在线观看| 99久久精品热视频| 干丝袜人妻中文字幕| 天堂中文最新版在线下载| 色视频在线一区二区三区| 国产成人精品一,二区| 在线观看免费日韩欧美大片 | 91久久精品国产一区二区成人| 精品久久久噜噜| 日本与韩国留学比较| 在线观看免费高清a一片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 免费观看a级毛片全部| 大香蕉97超碰在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 高清av免费在线| 亚洲av不卡在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 国产av国产精品国产| 夜夜爽夜夜爽视频| 日本vs欧美在线观看视频 | 在线精品无人区一区二区三 | 91狼人影院| 五月玫瑰六月丁香| av在线app专区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 99久久精品国产国产毛片| 18+在线观看网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美3d第一页| 久久久午夜欧美精品| 亚洲欧美清纯卡通| 精品少妇黑人巨大在线播放| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品国产a三级三级三级| 2022亚洲国产成人精品| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美xxⅹ黑人| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久婷婷青草| 五月玫瑰六月丁香| 国产日韩欧美亚洲二区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久精品夜色国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久影院123| 老熟女久久久| 国产一区二区三区av在线| 亚洲国产色片| av福利片在线观看| 18禁在线播放成人免费| 免费人成在线观看视频色| 国产一区二区在线观看日韩| 国产黄色视频一区二区在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 久久 成人 亚洲| 少妇的逼水好多| 99热这里只有是精品50| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 在线精品无人区一区二区三 | 看免费成人av毛片| 综合色丁香网| 亚洲无线观看免费| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费人成在线观看视频色| 久久久成人免费电影| 久热久热在线精品观看| 日日啪夜夜撸| 午夜福利影视在线免费观看| 国产高清不卡午夜福利| 欧美zozozo另类| 国产精品国产av在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 又爽又黄a免费视频| av播播在线观看一区| 人妻少妇偷人精品九色| 成人毛片60女人毛片免费| 日日摸夜夜添夜夜爱| 18+在线观看网站| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲精品视频女| 91精品国产国语对白视频| 晚上一个人看的免费电影| 女性被躁到高潮视频| 一个人免费看片子| 亚洲精品视频女| 草草在线视频免费看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 老熟女久久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 97热精品久久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 少妇人妻 视频| 水蜜桃什么品种好| 国产在线视频一区二区| 有码 亚洲区| 亚洲不卡免费看| 中文字幕av成人在线电影| 男女国产视频网站| 九九爱精品视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 一级毛片久久久久久久久女| 蜜桃久久精品国产亚洲av| av.在线天堂| 国产高清国产精品国产三级 | 国产爱豆传媒在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 中文在线观看免费www的网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美成人a在线观看| 欧美97在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲国产色片| 国产精品.久久久| 精品久久久久久久久av| 亚洲国产成人一精品久久久| 男女边摸边吃奶| 久久97久久精品| av专区在线播放| 国产成人免费观看mmmm| 国产中年淑女户外野战色| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产成人精品婷婷| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 中文天堂在线官网| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久毛片免费看一区二区三区| 成人国产麻豆网| 久久精品夜色国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲成人一二三区av| 亚洲av日韩在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 免费看不卡的av| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产69精品久久久久777片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久午夜福利片| 欧美激情国产日韩精品一区| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 大香蕉97超碰在线| 午夜免费男女啪啪视频观看| 七月丁香在线播放| 国产视频内射| 国产成人精品久久久久久| 免费大片18禁| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久国产乱子免费精品| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲欧美日韩东京热| 各种免费的搞黄视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品亚洲一区二区| 春色校园在线视频观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 精品久久久久久久久亚洲| 成年人午夜在线观看视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 男男h啪啪无遮挡| 波野结衣二区三区在线| 春色校园在线视频观看| 免费av不卡在线播放| 国产视频首页在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 超碰97精品在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 久久国产乱子免费精品| 一区二区三区免费毛片| 一个人免费看片子| 午夜福利高清视频| 久久97久久精品| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 色吧在线观看| 免费在线观看成人毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 舔av片在线| 精品亚洲成a人片在线观看 | 美女高潮的动态| 1000部很黄的大片| 久久6这里有精品| av视频免费观看在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 色视频www国产| 国产高潮美女av| 91久久精品国产一区二区成人| 免费看不卡的av| 亚洲国产欧美在线一区| 免费少妇av软件| 国产精品免费大片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 日韩成人伦理影院| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄色日韩在线| 我要看黄色一级片免费的| 波野结衣二区三区在线| 一本一本综合久久| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品无大码| 午夜精品国产一区二区电影| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产一区有黄有色的免费视频| 少妇的逼好多水| 日韩视频在线欧美| 国产成人91sexporn| 中文字幕制服av| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲精品亚洲一区二区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 女性生殖器流出的白浆| 99久久精品国产国产毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 麻豆乱淫一区二区| 又大又黄又爽视频免费| 一级爰片在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 十八禁网站网址无遮挡 | 久久久久久久久久久丰满| av免费在线看不卡| av专区在线播放| 一级二级三级毛片免费看| 97超碰精品成人国产| 亚洲国产欧美人成| 国产乱人偷精品视频| 精品久久久噜噜| 亚洲成人av在线免费| 亚洲成人手机| 久久女婷五月综合色啪小说| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产精品999| a级毛片免费高清观看在线播放| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本av免费视频播放| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品av视频在线免费观看| 美女高潮的动态| 亚洲天堂av无毛| 如何舔出高潮| 亚洲天堂av无毛| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲成人一二三区av| av免费观看日本| 久热久热在线精品观看| 看非洲黑人一级黄片| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲欧美精品专区久久| 国产乱来视频区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲在久久综合| 亚洲内射少妇av| 一个人免费看片子| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产大屁股一区二区在线视频| 好男人视频免费观看在线| 久久久久久久国产电影| 五月伊人婷婷丁香| 少妇熟女欧美另类| 在线观看免费日韩欧美大片 | 欧美最新免费一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av在线老鸭窝| 亚洲美女视频黄频| 国产精品伦人一区二区| 国产精品一及| 国产精品成人在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美日韩综合久久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲色图综合在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品久久久久久精品古装| 国产成人精品福利久久| 日韩制服骚丝袜av| 黑人猛操日本美女一级片| 久久午夜福利片| 人妻系列 视频| 国产 一区 欧美 日韩| 99精国产麻豆久久婷婷| 99久久精品热视频| 伦理电影免费视频| 一级黄片播放器| 另类亚洲欧美激情| 国产亚洲5aaaaa淫片| 夫妻午夜视频| 人妻少妇偷人精品九色| 新久久久久国产一级毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品久久精品一区二区三区| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲成人av在线免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 美女国产视频在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久精品国产国产毛片| 直男gayav资源| 国产av精品麻豆| 99久久中文字幕三级久久日本| 日本一二三区视频观看| 观看免费一级毛片| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美成人a在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 国产黄片视频在线免费观看| 国产v大片淫在线免费观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 97超视频在线观看视频| 日本欧美国产在线视频| 联通29元200g的流量卡| 制服丝袜香蕉在线| 国产成人精品婷婷| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 插逼视频在线观看| 国产成人精品婷婷| a级毛色黄片| 九草在线视频观看| 亚洲精品乱久久久久久| 国产美女午夜福利| 尾随美女入室| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲四区av| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美另类一区| 欧美精品亚洲一区二区| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 一本久久精品| 日韩视频在线欧美| 最黄视频免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲在久久综合| 搡老乐熟女国产| 国产一区二区三区综合在线观看 | 一区二区三区乱码不卡18| 国产 一区 欧美 日韩| 永久网站在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产亚洲一区二区精品| 日韩电影二区| 只有这里有精品99| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 黑人猛操日本美女一级片| 网址你懂的国产日韩在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 99热国产这里只有精品6| 中文字幕久久专区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 高清黄色对白视频在线免费看 | 国产探花极品一区二区| 大香蕉97超碰在线| 国产精品无大码| 欧美97在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 免费观看性生交大片5| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 99国产精品免费福利视频| 99久久精品热视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 人体艺术视频欧美日本| 久久影院123| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲电影在线观看av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 草草在线视频免费看| 国产午夜精品一二区理论片| 好男人视频免费观看在线| 日日啪夜夜撸| 老女人水多毛片| 最近中文字幕高清免费大全6| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲色图av天堂| 99热全是精品| 日韩三级伦理在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 99久国产av精品国产电影| 日本色播在线视频| 99热这里只有是精品50| 校园人妻丝袜中文字幕| 免费观看在线日韩| 香蕉精品网在线| 国产男女内射视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 日韩一区二区三区影片| 日韩中文字幕视频在线看片 | 日本欧美国产在线视频| 在线观看一区二区三区|