PCR-DGGE技術(shù)在城鎮(zhèn)供排水系統(tǒng)微生物多樣性研究中的應(yīng)用

賈淑宇，張克峰，逯南南，王明泉，趙清華,孫韶華，賈瑞寶

(1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心，山東 濟(jì)南 250013)

目前微生物多樣性是微生物生態(tài)學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容之一，通過(guò)研究微生物多樣性從而將微觀的微生物群落結(jié)構(gòu)與宏觀的生態(tài)系統(tǒng)功能之間緊密相連。在自然環(huán)境中，僅有0.1% ～1%的微生物可以通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測(cè)與分離[1]，大量的微生物以活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的形式存在，如霍亂弧菌、產(chǎn)毒素大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、肺炎桿菌、宋內(nèi)志賀氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌等[2]，這些非可培養(yǎng)狀態(tài)的微生物對(duì)人類健康構(gòu)成了潛在的威脅。

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)是目前微生物研究的一種趨勢(shì)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的技術(shù)廣泛運(yùn)用于微生物的鑒定中，其中變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技術(shù)是檢測(cè)微生物多樣性的技術(shù)手段之一。Fischer等[3]最早利用DGGE技術(shù)檢測(cè)DNA片段中的點(diǎn)突變；Muyzer等[4]第一次利用DGGE技術(shù)分析了復(fù)雜微生物種群遺傳的多樣性，之后該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究水體、土壤[5]、活性污泥、沉積物[6-7]等環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性及其動(dòng)態(tài)變化，包括細(xì)菌、真菌、藻類和真核原生生物群落[8-10]等；近幾年DGGE技術(shù)也常用于研究微生物能源的開(kāi)發(fā)[11]。

基于上述研究，本文概述了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(Ploymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)技術(shù)的原理和特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)水體微生物相關(guān)研究成果的系統(tǒng)分析，總結(jié)并歸納了PCR-DGGE技術(shù)在城鎮(zhèn)供水系統(tǒng)和污水處理系統(tǒng)中微生物多樣性分析等方面的研究進(jìn)展和應(yīng)用成效，為該技術(shù)在水環(huán)境中微生物多樣性的研究提供理論依據(jù)。

1 PCR-DGGE技術(shù)的原理和特點(diǎn)

1.1 PCR-DGGE技術(shù)的原理

普通凝膠電泳無(wú)法分開(kāi)長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA片段，變性梯度凝膠電泳(DGGE)是在聚丙烯酰胺凝膠中加入線性梯度的尿素和甲酰胺作為變性劑，以區(qū)分長(zhǎng)度相等但序列不同的DNA分子。電泳時(shí)隨著變性劑濃度的升高， DNA雙鏈序列遷移到變性凝膠一定位置并達(dá)到其解鏈溫度時(shí)便開(kāi)始部分解鏈，DNA雙鏈末端一旦開(kāi)始解鏈，其在凝膠中的電泳速度將大幅度下降。長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA片段的解鏈區(qū)域及解鏈溫度都不同，它們?cè)谀z中不同位置發(fā)生部分解鏈而導(dǎo)致遷移速率大大下降，泳動(dòng)受阻的DNA片段在不同位置停留，從而達(dá)到分離不同序列DNA片段的目的。

序列不同的DNA片段最終以電泳圖像展現(xiàn)出來(lái)，采用Quantity One 分析軟件通過(guò)對(duì)電泳條帶進(jìn)行定量分析，分析結(jié)果可作為微生物多樣性統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通常以Shannon-Weiner(H)指數(shù)來(lái)反映群落中微生物的種類，群落中微生物的種類增多代表群落的復(fù)雜程度增加，即H值愈大，表明群落中所含微生物的種類越多；以Pielou’s均勻度指數(shù)(E)估計(jì)該群落物種分布的均勻度[12]。具體計(jì)算公式如下：

(1)

E=H/lnS

(2)

式中:pi表示第i個(gè)種群的相對(duì)多度,pi=ni/N(其中ni為第i個(gè)種群的個(gè)體數(shù)；N為群落中所有種群的個(gè)體總數(shù))；S表示物種的豐度，即樣本中含有的物種總數(shù)。

PCR-DGGE技術(shù)的操作過(guò)程復(fù)雜(見(jiàn)圖1)，每個(gè)環(huán)節(jié)皆有可能影響研究結(jié)果，眾多研究者在減少干擾、提高方法準(zhǔn)確度等方面做了大量的工作。如吳敏娜等[13]研究發(fā)現(xiàn)采用異硫氰酸胍(Guandine Thiocyanate,GITC)法提取DNA可獲得較高的濃度和純度，是一種較為理想的DNA提取方法。在進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴(kuò)增時(shí)，由于靶基因擴(kuò)增幾率不同，會(huì)造成擴(kuò)增偏差，Korbie等[14]證明采用降落PCR技術(shù)可提高PCR擴(kuò)增的特異性和靈敏度，使用多種引物同時(shí)分析亦可減少擴(kuò)增偏差。DGGE技術(shù)通常使用溴化乙啶(Ethidium Bromide,EB)作凝膠染色劑，其操作簡(jiǎn)單，但它是一種具有高誘變性的化學(xué)物質(zhì)，且靈敏度較低，染色后背景熒光信號(hào)較高；Gel Red和Gel Green 是近年來(lái)新興的兩種安全穩(wěn)定的熒光核酸凝膠染色劑，無(wú)論是用于預(yù)制凝膠染色還是凝膠電泳后染色，都具有極高的靈敏度。

圖1 PCR-DGGE技術(shù)的基本操作流程Fig.1 Flow chart of the basic operation of PCR- DGGE technology

1.2 PCR-DGGE技術(shù)的特點(diǎn)

基于研究的技術(shù)類型，一般將微生物多樣性研究方法分為兩大類：傳統(tǒng)生物化學(xué)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)。傳統(tǒng)生物化學(xué)方法包括異養(yǎng)菌平板計(jì)數(shù)法(Heterotrophic Plate Counts,HPC)、光學(xué)顯微鏡分析、Biolog微平板分析、磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)譜圖分析、脂肪酸甲酯(Fatty Acid Methyl Esters，F(xiàn)AME)譜圖分析等，這些方法適用范圍與精度各不相同，各有其優(yōu)缺點(diǎn)：非可培養(yǎng)微生物影響HPC結(jié)果的準(zhǔn)確性；部分細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異不明顯，很難在光學(xué)顯微鏡下區(qū)分，且缺乏細(xì)胞壁的微生物固定后很容易變形，更難在顯微鏡下進(jìn)行分類鑒定；Biolog微平板分析能夠進(jìn)行95種唯一碳源的生化反應(yīng)測(cè)試，靈敏度高，但精度一般；PLFA和FAME譜圖分析可以定量描述微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，但針對(duì)特異微生物類群的鑒定還不夠準(zhǔn)確?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從基因?qū)用嫜芯课⑸锏亩鄻有?，如核酸探針、生物芯片、雙向電泳、熒光定量PCR技術(shù)等，這些技術(shù)可以對(duì)某一特定微生物種類進(jìn)行定性鑒定，甚至還可做定量分析，但它們不能對(duì)環(huán)境中共存的其他微生物進(jìn)行鑒定。

PCR-DGGE技術(shù)有效解決了上述問(wèn)題，能夠快速、全面、準(zhǔn)確地獲得樣品中微生物的信息，較傳統(tǒng)生物化學(xué)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，被越來(lái)越多的微生物研究學(xué)者所推崇，但該技術(shù)也存在一些弊端，其優(yōu)缺點(diǎn)詳見(jiàn)表1。

表1 PCR-DGGE技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

從最初用于檢測(cè)點(diǎn)突變到分析微生物多樣性及其動(dòng)態(tài)變化，PCR-DGGE技術(shù)不斷得到改進(jìn)，已衍生出溫度梯度凝膠電泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis,TGGE)、瞬時(shí)溫度梯度電泳(Transient Temperature Gradient Electrophoresis,TTGE)和恒定變性凝膠電泳(Constant Denatured Gel Electrophoresis,CDGE)等技術(shù)，使其操作方法不斷優(yōu)化且結(jié)果準(zhǔn)確性有所提高，而在DGGE技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的雙梯度DGGE(Double-Gradient Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DG-DGGE)[15-16]技術(shù)、依賴培養(yǎng)的DGGE(Culture-Dependent Gradient Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,CD-DGGE)[17]技術(shù)等，使DNA片段條帶展現(xiàn)得更加清晰、全面，同時(shí)DGGE技術(shù)結(jié)合熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)[18]技術(shù)、微電極測(cè)量技術(shù)[19]等方法進(jìn)行綜合分析，克服了PCR-DGGE技術(shù)的弊端，可為更詳細(xì)、準(zhǔn)確地分析微生物群落的復(fù)雜性服務(wù)，這些都將使PCR-DGGE技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著愈來(lái)愈重要的作用。

2 PCR-DGGE技術(shù)的應(yīng)用

隨著PCR-DGGE技術(shù)體系的日益成熟，已被越來(lái)越多地應(yīng)用于水環(huán)境中微生物多樣性的檢測(cè)，尤其在城鎮(zhèn)供水系統(tǒng)和污水處理系統(tǒng)中微生物多樣性檢測(cè)方面的大量應(yīng)用，將有助于了解其微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境及人類健康具有重大的意義。

2.1 PCR-DGGE技術(shù)在城鎮(zhèn)供水系統(tǒng)中的應(yīng)用

眾多學(xué)者利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)城鎮(zhèn)供水系統(tǒng)中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定(見(jiàn)表2)，以表征城鎮(zhèn)供水系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為水源水質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)控、水廠消毒處理工藝運(yùn)行以及管網(wǎng)水質(zhì)安全保障提供微生物學(xué)的基礎(chǔ)信息。

表2 PCR-DGGE技術(shù)在城鎮(zhèn)供水系統(tǒng)中的應(yīng)用

2.1.1 水源生態(tài)系統(tǒng)

(3) 若Uα,取V=[α],則對(duì)任意的(x,z)V°V,存在L,使得(x,y)V, (y,z)V。由[α]的定義知(x→y)?(y→z)≥α,同時(shí)(y→z)?(z→y)≥α。

PCR-DGGE技術(shù)可用于藻類水華防治，Ye等[20]利用DGGE技術(shù)和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，分析了太湖水體和沉積物樣品中藍(lán)藻種群的時(shí)空分布及其與水華形成的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)微囊藻和聚球藻為優(yōu)勢(shì)藍(lán)細(xì)菌，且水華產(chǎn)生和消退與水環(huán)境中細(xì)菌群落密切相關(guān)；Wang等[21]從塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)培養(yǎng)物中提取細(xì)菌DNA擴(kuò)增16S rRNA基因片段，并進(jìn)行DGGE分析測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在藻類裂解過(guò)程中“藻際”細(xì)菌群落(由于藻向環(huán)境釋放大量有機(jī)物質(zhì)，使藻細(xì)胞周圍形成一種獨(dú)特的、可稱為“藻際”的微環(huán)境，這種環(huán)境中聚集著大量細(xì)菌，形成具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)與功能的“藻際”細(xì)菌群落)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，Alteromonassp.和Thalassobiusaestuariisp.是引起藻類裂解的關(guān)鍵因素，“藻際”細(xì)菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶和幾丁質(zhì)酶能直接導(dǎo)致藻類裂解；Yang等[22]通過(guò)對(duì)中國(guó)廈門海域Akashiwosanguinea赤潮與其細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)關(guān)系研究，首次證明了細(xì)菌群落特別是丙型變形菌綱(Gammaproteobacteria)在調(diào)控赤潮中具有重要的作用，Sediminimonasqiaohouensis細(xì)菌與Akashiwosanguinea赤潮呈負(fù)相關(guān)，這種細(xì)菌可能是赤潮的重要負(fù)調(diào)控因子之一。

PCR-DGGE技術(shù)也可用于水源生態(tài)系統(tǒng)中真菌群落結(jié)構(gòu)的研究。真菌種類豐富、代謝能力強(qiáng)、生命活動(dòng)過(guò)程復(fù)雜，在水源生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)中起著重要的作用，水生真菌種類組成及其季節(jié)演替是它們?cè)谒瓷鷳B(tài)系統(tǒng)中作用的關(guān)鍵。然而普通引物很難適用于水生真菌群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè)與鑒定，特別是壺菌門和隱真菌門。Ishii等[23]研究發(fā)現(xiàn)水生真菌DGGE分析中ff390w/ef3r引物對(duì)特異性最高，適合水生真菌群落結(jié)構(gòu)的檢測(cè),而f390w/ef3r GC引物對(duì)可用于分析檢測(cè)水生真菌群落結(jié)構(gòu)的演替，這對(duì)研究水生真菌群落結(jié)構(gòu)及其季節(jié)演替具有重要的意義。

2.1.2 給水處理系統(tǒng)

水處理工藝不同階段微生物群落結(jié)構(gòu)具有明顯的差異性，對(duì)飲用水處理過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)解析可為優(yōu)化工藝參數(shù)提供依據(jù)。如張錫輝等[24]利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)深圳市某水庫(kù)原水、飲用水處理廠進(jìn)水及出水微生物群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)細(xì)菌類群影響水質(zhì),即原水中存在腸道致病菌氣單胞菌屬影響水源微生物安全性，生絲微菌和光合細(xì)菌紅假單胞菌均具有凈化水質(zhì)的能力；Tian等[25]在以臭氧/活性炭為主的飲用水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了7種優(yōu)勢(shì)菌群，且不同處理階段優(yōu)勢(shì)菌群有所差異，其中擬桿菌和γ-變形桿菌的含量經(jīng)臭氧和活性炭過(guò)濾處理后急劇下降，厚壁菌經(jīng)臭氧和活性炭處理后逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌；Ma等[26]采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)兩個(gè)不同飲用水處理廠污泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)污泥微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多種類型微生物大量存在其中，DGGE條帶相似性分析得出27條優(yōu)勢(shì)條帶中包含9種門類，為自來(lái)水廠污泥無(wú)害化處理提供了有效信息。

2.1.3 管網(wǎng)輸配系統(tǒng)

管網(wǎng)輸配系統(tǒng)中不同管材內(nèi)壁提供了不同的生長(zhǎng)環(huán)境，所附著的管網(wǎng)生物膜微生物群落結(jié)構(gòu)也有所差異，而不同消毒劑的組成和濃度也會(huì)影響管網(wǎng)內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)。當(dāng)管網(wǎng)生物膜因新陳代謝或水力條件改變[27]發(fā)生脫落時(shí)會(huì)影響水體的色度和氣味，甚至?xí)?duì)人體健康造成威脅。Rozej等[28]將自來(lái)水引入非增塑聚氯乙烯(PVC)、硅烷交聯(lián)聚乙烯(PEX)和高密度聚乙烯(HDPE)3種不同材料的塑料管道，在系統(tǒng)運(yùn)行2年后通過(guò)掃描電子顯微鏡、HPC技術(shù)、DGGE技術(shù)分析管網(wǎng)生物膜微生物的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：塑料管網(wǎng)生物膜形成能力因使用材料不同而有所差異，且管網(wǎng)生物膜形成的敏感性表現(xiàn)為HDPE >PEX> PVC；生物膜在管內(nèi)表面結(jié)構(gòu)和微生物群落結(jié)構(gòu)方面存在差異性；雖然微生物多樣性和豐富度受管材影響，但微生物數(shù)量與管材無(wú)關(guān)。 Roeder等[29]通過(guò)DGGE技術(shù)比較了不同消毒劑對(duì)管網(wǎng)生物膜微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)消毒方法引起的管網(wǎng)生物膜微生物種群選擇壓力取決于消毒劑的組成和濃度，消毒劑對(duì)飲用水管網(wǎng)生物膜微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生極大的影響。因此，在評(píng)價(jià)飲用水設(shè)施消毒方法的有效性時(shí)，不僅要考慮某些細(xì)菌的減少，而且要注意管網(wǎng)生物膜微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。

2.2 PCR-DGGE技術(shù)在污水處理系統(tǒng)中的應(yīng)用

活性污泥法和生物膜法是較為常用的污水生物處理方式，通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)了解污水處理過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化(見(jiàn)表3)，可為污水處理?xiàng)l件的優(yōu)化、污水處理效率的提高以及廢水中微生物資源的利用與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

2.2.1 活性污泥法

PCR-DGGE技術(shù)可用于比較微生物群落結(jié)構(gòu)的差異以及監(jiān)測(cè)和控制污水處理過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。 Aell等[30]通過(guò)對(duì)A2/O和倒置A2/O兩種處理系統(tǒng)的活性污泥進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Microthrixparvicella和NostocoidalimicolaI是導(dǎo)致污泥膨脹的主要原因，這兩種處理系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性較高，但兩種系統(tǒng)在相同周期內(nèi)經(jīng)歷了不同微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，因此處理效果存在一定的差異性；Boon等[31]通過(guò)分析4種不同類型污水的活性污泥菌群多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)污水種類是影響活性污泥群落結(jié)構(gòu)的重要因素；Liu等[32]對(duì)處理中藥工業(yè)污水的厭氧折流反應(yīng)器(PABR)中4個(gè)不同隔斷微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究， DGGE分析顯示：在正常負(fù)荷下和有機(jī)負(fù)荷(OLR)穩(wěn)定階段，每個(gè)隔斷微生物群落結(jié)構(gòu)趨于相似；在OLR增高階段，不同隔斷同一取樣時(shí)間微生物樣本的群落結(jié)構(gòu)并不相同，且同一隔斷不同取樣時(shí)間微生物樣本的群落結(jié)構(gòu)也不相同；在OLR超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)階段，出水水質(zhì)迅速惡化，微生物群落結(jié)構(gòu)變化顯著。

表3 PCR-DGGE技術(shù)在污水處理系統(tǒng)中的應(yīng)用

2.2.2 生物膜法

國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者利用PCR-DGGE技術(shù)體系對(duì)膜生物反應(yīng)器(Membrane Bio-Reactor,MBR)和序批式生物膜反應(yīng)器(Sequencing Biofilm Batch Reactor,SBBR)這兩種膜分離技術(shù)與生物處理技術(shù)有機(jī)結(jié)合的新型廢水處理工藝中生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。如牟潔等[33]利用PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)MBR中具有獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)，其中氣單胞菌屬、假單胞菌、亞硝酸菌屬、從毛單胞菌屬和桿菌等優(yōu)勢(shì)菌群在該反應(yīng)器去除有機(jī)物的過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用;Liu等[34]研究了MBR與蚯蚓反應(yīng)器聯(lián)合處理綜合污水中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合反應(yīng)器(S-MBR)中微生物群落結(jié)構(gòu)比傳統(tǒng)MBR(C-MBR)更多樣化，一些富集在S-MBR中生長(zhǎng)緩慢的微生物如腐敗螺旋菌、放線菌、固氮菌、梭狀芽孢桿菌、假單胞菌等，有利于提高COD去除率、減少污泥量及減緩膜污染；Xin等[35]通過(guò)DGGE技術(shù)、FISH技術(shù)和16S rRNA擴(kuò)增子焦磷酸測(cè)序法研究了SBBR中含氮廢水的同步硝化、厭氧氨氧化和反硝化工藝在不同底物濃度下微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)氨氮濃度從2 200 mg/L下降到50 mg/L時(shí)，氨氧化菌的相對(duì)含量下降，而厭氧氨氧化細(xì)菌相對(duì)含量無(wú)明顯變化，且在反硝化系統(tǒng)中Nitrosomonaseuropaea為氨氧化菌的優(yōu)勢(shì)菌屬，厭氧氨氧化菌的優(yōu)勢(shì)菌屬是CandidatusBrocadia;Li等[36]研究了SBBR中林可霉素污水共代謝降解及微生物群落的多樣性，DGGE和16S rDNA結(jié)果顯示共代謝系統(tǒng)中微生物種群多樣性較對(duì)照組更為豐富，Roseovarius(3.35%)、Thiothrix(2.74%)、Halomonas(2.49%)、Ignavibacterium(2.02%)和Tm7_genus_incertae_sedis(1.93%)為優(yōu)勢(shì)菌屬，共代謝是不同優(yōu)勢(shì)菌屬的協(xié)同作用，這對(duì)林可霉素及其類似物的生物修復(fù)具有重要的啟示。

2.2.3 自然生物處理法

PCR-DGGE技術(shù)可用于自然生物處理系統(tǒng)中微生物群落多樣性的檢測(cè)，能夠有效指導(dǎo)調(diào)控該系統(tǒng)參數(shù)，達(dá)到高效凈水的目的，目前其在自然生物處理系統(tǒng)的穩(wěn)定塘和濕地系統(tǒng)中的應(yīng)用最為廣泛。PCR-DGGE技術(shù)可研究濕地系統(tǒng)中的微生物數(shù)量、豐度及多樣性，并分離鑒別濕地系統(tǒng)中具有特定功能的微生物群落[37]，對(duì)研究濕地系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)及分布、污染物降解機(jī)制等方面具有重要的意義。如Adrados等[38]利用端點(diǎn)PCR和DGGE技術(shù)分析了丹麥3個(gè)不同生活污水處理系統(tǒng)(水平流人工濕地、垂直流人工濕地和生物濾池)中細(xì)菌和古細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)與處理系統(tǒng)設(shè)計(jì)和有機(jī)物負(fù)荷有關(guān)，而微生物群落與污水進(jìn)水之間無(wú)明確關(guān)系；郭冀峰等[39]利用PCR-DGGE技術(shù)分析了南北兩地區(qū)農(nóng)村穩(wěn)定塘底泥系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)南北方兩地區(qū)農(nóng)村穩(wěn)定塘底泥系統(tǒng)中微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性基本相似，無(wú)明顯區(qū)別。大部分受污染環(huán)境的修復(fù)是在人工協(xié)助下進(jìn)行的自然生物凈化，Hassanshahian等[40]利用PCR- DGGE技術(shù)分析了海洋石油污染過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原油污染會(huì)降低海洋微生物群落的多樣性；在海洋環(huán)境修復(fù)過(guò)程中，不同種類細(xì)菌之間的相互作用會(huì)抑制海洋環(huán)境的生物修復(fù)，使用單一細(xì)菌降解海洋石油污染比使用細(xì)菌共同體更具有優(yōu)勢(shì)。

目前污水無(wú)害化處理主要依賴細(xì)菌的作用，因?yàn)檎婢茈y與生物反應(yīng)器中其他微生物競(jìng)爭(zhēng)。如Badia-Fabregat等[41]研究了污水中細(xì)菌和真菌群落對(duì)真菌處理性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多土著真菌會(huì)與接種真菌競(jìng)爭(zhēng)影響污水處理的效果。因此，如何解決接種真菌在生物競(jìng)爭(zhēng)中的劣勢(shì)問(wèn)題，還有待進(jìn)一步探究以期獲得良好的污水處理效果。

3 結(jié)論與展望

PCR-DGGE技術(shù)以其檢測(cè)限低、快速、準(zhǔn)確、全面等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域，同時(shí)該技術(shù)自身也在不斷完善，正與越來(lái)越多的新興技術(shù)方法融合發(fā)展，并在城鎮(zhèn)供排水系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究方面得到了廣泛應(yīng)用：①分離鑒定城鎮(zhèn)供水系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)菌群，有效防治水華及調(diào)控赤潮，監(jiān)測(cè)控制水處理過(guò)程中藻類與致病微生物的暴發(fā)，為提高供水系統(tǒng)生物穩(wěn)定性提供技術(shù)支撐；②分析研究城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中微生物礦化污染物的原理及作用過(guò)程，為提高污染物處理效率、優(yōu)化污染物處理工藝及修復(fù)受污染環(huán)境提供理論指導(dǎo)。

PCR-DGGE技術(shù)作為分子生物學(xué)研究的技術(shù)手段已經(jīng)較為成熟，結(jié)合城鎮(zhèn)供排水系統(tǒng)微生物多樣性的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)，未來(lái)仍需從以下幾方面繼續(xù)開(kāi)展系統(tǒng)、深入的研究：①針對(duì)PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中存在的共遷移和異質(zhì)性等問(wèn)題，改進(jìn)技術(shù)方法或結(jié)合新興技術(shù)降低這些問(wèn)題對(duì)研究結(jié)果的影響，以提高基因片段分離率與結(jié)果準(zhǔn)確性；②系統(tǒng)探索細(xì)菌、真菌和藻類等其他類型水生微生物群落結(jié)構(gòu)的研究方法，進(jìn)一步完善技術(shù)應(yīng)用方法學(xué)體系，以拓寬技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域和范圍；③深入探討微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)水環(huán)境的作用機(jī)理及其影響因素，提高城鎮(zhèn)供水系統(tǒng)的生物穩(wěn)定性和城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)的處理效率，并探明微生物群落與其他類型群落之間的相互作用，進(jìn)一步評(píng)價(jià)生態(tài)系統(tǒng)功能，為水環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)與保護(hù)提供有力的科學(xué)依據(jù)。