SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)條件的響應面優(yōu)化分析

夏 雄，鄧 妍，劉 威，陸天陽，許 霞，王怡人，羅俊杰

(1.常州大學環(huán)境與安全工程學院,江蘇 常州 213164；2.常州大學懷德學院,江蘇泰州 214500；3.邯鄲市環(huán)境保護局督查中心,河北 邯鄲 056000)

酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)是利用酶制劑水解破壞剩余污泥細菌的細胞壁，從而達到使細胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)溶出的目的[1-4]。目前使用酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)主要存在對細胞壁的破壞效果較差，需要大量的水解酶進行長時間的水解過程，從而造成成本較高等問題[5]。十二烷基硫酸鈉(SDS)作為一種陰離子表面活性劑，在其分子兩端分別分布著親水基和憎水基，形成了一種特殊的不對稱結構[6]，正是這種獨特的分子結構，使得SDS具有良好的兩親性和增溶作用[7-8]。因此，本次試驗選取添加SDS表面活性劑來促進復合酶水解剩余污泥蛋白質(zhì)，并在研究復合酶(堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=4∶1)水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的最佳提取條件(液固比為5∶1、復合酶加酶量為5.23%、反應溫度為54.7℃、初始pH值為7.7和反應時間為3.2 h，剩余污泥蛋白質(zhì)最大提取率為60.83%)的基礎上，研究了SDS對復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的促進作用，并通過響應面分析法優(yōu)化其提取條件。

1 材料與方法

1. 1 污泥樣品

剩余污泥來源于江蘇省常州市某市政污水處理廠壓結后的固體污泥，取回污泥樣品后存放在冰箱內(nèi)，調(diào)節(jié)溫度至(4±0.5)℃。該剩余污泥樣品的相關特性指標為：pH值6.7，含水率78.6%，蛋白質(zhì)含量40.2%(相對于剩余污泥干物質(zhì)的質(zhì)量)。

1. 2 主要試劑和儀器

本試驗所用試劑主要包括：木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、SDS、福林酚試劑、牛血清白蛋白、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅、亞甲基藍和溴甲酚綠等。

本試驗所用儀器主要包括：電熱鼓風干燥箱、pH計、多頭磁力加熱攪拌器、新世紀紫外/可見分光光度計、離心沉淀器和凱氏定氮裝置等。

1. 3 測定方法

(1) 剩余污泥中蛋白含量按照我國食品安全國家標準《食品中蛋白質(zhì)的測定》(GB 5009.5—2010)中的方法進行測定。

(2) 剩余污泥蛋白質(zhì)提取液的蛋白質(zhì)含量采用福林酚試劑法進行測定。

1. 4 試驗方法

SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的試驗方法如下：先取適量剩余污泥置于250 mL燒杯內(nèi)，按照液固比為5∶1向燒杯內(nèi)添加適量的蒸餾水，之后通過一定濃度的稀鹽酸或稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值；然后調(diào)節(jié)水浴溫度至所需恒定溫度，按照5.23%的添加量(相對于污泥質(zhì)量)加入一定量的復合酶，并按照復合酶的加酶量加入一定量的SDS，在一定轉(zhuǎn)速條件下攪拌、水解一段時間，反應結束后，將污泥料漿置于100℃水浴條件下15 min，將蛋白酶滅活；最后將污泥料漿倒入離心管，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，離心后取上清液，即為剩余污泥蛋白質(zhì)提取液。

1. 5 試驗方案

首先在確定復合酶加酶量為5.23%和提取過程中液固比為5∶1的條件下進行單因素試驗，分別考察初始pH值(7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0)、反應溫度(51℃、53℃、55℃、57℃、59℃和61℃)、反應時間(1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h)和SDS投加量(6%、7%、8%、9%、10%和11%)4個因素對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響；然后根據(jù)單因素試驗結果，采用響應面分析法，以剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率(R)為響應值，研究初始pH值(A)、反應溫度(B)、反應時間(C)和SDS投加量(D)對響應值(R)的影響，每個因素取3個水平，設計了四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 初始pH值對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響

本試驗設置反應過程中初始pH值分別為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0，其他反應條件為：液固比5∶1，復合酶加酶量5.23%，反應溫度55℃，反應時間3 h，SDS投加量8%，考察了初始pH值對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響，其試驗結果見圖1。

圖1 初始pH值對SDS促進復合酶水解法提取剩余 污泥蛋白質(zhì)的影響Fig.1 Effect of initial pH on protein extraction from excess sludge with enhanced enzymatic hydrolysis by SDS and complex enzyme

由圖1可見，SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)最適宜的初始pH值為7.4，此時剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率為65.51%；添加SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)最適宜的初始pH值為7.4，相較于未添加SDS的復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)最適宜的初始pH值7.7有所降低，這是因為SDS作為添加劑會提高反應體系的pH值。分析原因認為：一方面，SDS在蒸餾水中溶解后本身就處于弱堿性的狀態(tài)，故當其作為添加劑時會使反應體系的pH值稍有上升；另一方面，在復合酶水解提取剩余污泥蛋白質(zhì)的初期，反應體系的pH值主要受氨氮等物質(zhì)的影響，而這些物質(zhì)又屬于堿性物質(zhì)，在SDS的加入促進復合酶水解的同時直接導致氨氮等堿性物質(zhì)的含量增大，最終使得反應體系的pH值有所上升。

2.1.2 反應溫度對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響

本試驗設置反應溫度分別為51℃、53℃、55℃、57℃、59℃和61℃，其他反應條件為：液固比5∶1，復合酶加酶量5.23%，初始pH值7.4，反應時間3 h，SDS投加量8%，考察了反應溫度對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響，其試驗結果見圖2。

圖2 反應溫度對SDS促進復合酶水解法提取剩余污 泥蛋白質(zhì)的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on protein extraction from excess sludge with enhanced enzymatic hydrolysis by SDS and complex enzyme

由圖2可見，反應溫度對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的效果有較大的影響，在反應溫度為51～57℃的范圍內(nèi)，SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率與反應溫度呈正相關，但當反應溫度繼續(xù)升高超過57℃后，SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率與反應溫度呈負相關。分析原因認為：雖然添加了SDS后，隨著反應溫度的升高，SDS的增溶效果越來越顯著，更有利于大量的碳水化合物和蛋白質(zhì)脫離污泥顆粒表面并溶解到液相中，但是在復合酶水解提取污泥蛋白質(zhì)的過程中并不是反應溫度越高越有利，這是因為復合酶本身也是一種蛋白質(zhì)，超過最合適溫度后會導致蛋白質(zhì)變性，大部分酶蛋白質(zhì)結構被破壞，從而造成蛋白酶不能正常發(fā)揮催化作用。故SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)最適宜的反應溫度為57℃，此時剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率為67.53%。

2.1.3 反應時間對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響

本試驗設置反應時間分別為1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h，其他反應條件為：液固比5∶1，復合酶加酶量5.23%，初始pH值7.4，反應溫度57℃，SDS投加量8%，考察了反應時間對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響，其試驗結果見圖3。

圖3 反應時間對SDS促進復合酶提取剩余污泥蛋白 質(zhì)的影響Fig.3 Effect of reaction time on protein extraction from excess sludge with enhanced enzymatic hydrolysis by SDS and complex enzyme

由圖3可見，在反應時間為2.5 h時出現(xiàn)了SDS促進復合酶提取剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的最大值68.32%，與復合酶提取剩余污泥蛋白質(zhì)時最適宜的反應時間3.2 h相比，剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率的最大值出現(xiàn)時間提前。分析原因認為：SDS作為一種表面活性劑，具有一定的增溶作用，主要表現(xiàn)為在復合酶水解提取剩余污泥蛋白質(zhì)過程中，SDS的加入使得原本吸附于污泥表面的碳水化合物和蛋白質(zhì)提前脫附，也就是說原本難以破壞的胞外多聚物被提前破壞，復合酶更加直接地作用于污泥微生物細胞，復合酶水解的反應速率持續(xù)增大，從而導致SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率的最大值提前出現(xiàn)。

2.1.4 SDS投加量對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響

本試驗設置SDS投加量分別為6%、7%、8%、9%、10%和11%，其他反應條件為：液固比5∶1，復合酶加酶量5.23%，初始pH值7.4，反應溫度57℃，反應時間2.5 h，考察了SDS投加量對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響，其試驗結果見圖4。

圖4 SDS投加量對SDS促進復合酶水解法提取剩余 污泥蛋白質(zhì)的影響Fig.4 Effect of SDS dosage on protein extraction from excess sludge with enhanced enzymatic hydrolysis by SDS and complex enzyme

由圖4可見，隨著SDS投加量的增加，SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率逐漸升高，在SDS投加量從6%增加到8%的過程中，剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率不斷上升；當SDS投加量超過8%后，SDS投加量的增加并沒有引起剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的明顯變化。分析原因認為：SDS作為一種陰離子表面活性劑，在SDS投加量較少的情況下其增溶作用表現(xiàn)顯著，但是當SDS投加量過多時，其增溶作用趨于飽和，出現(xiàn)剩余污泥蛋白質(zhì)提取率不再繼續(xù)升高的現(xiàn)象。故綜合考慮確定SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)最佳的SDS投加量為8%，此時剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率達到68.34%。

2.2 SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)提取工藝的響應面優(yōu)化試驗結果與分析

2.2.1 響應面優(yōu)化試驗設計與結果分析

根據(jù)單因素試驗結果，本文利用響應面分析法，采用Design Expert 10軟件中的Box-Behnken Design模型設計響應面優(yōu)化試驗的相關試驗方案[9-10]，設定響應面優(yōu)化試驗的4個因素分別為初始pH值(A)、反應溫度(B)、反應時間(C)和SDS投加量(D)，并確定各因素的3個水平，設計了四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，詳見表1。響應面優(yōu)化試驗過程中其余試驗條件分別如下：復合酶中堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶之比為4∶1，復合酶加酶量為5.23%，液固比為5∶1。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素水平設計表

通過將響應面優(yōu)化試驗得到的試驗值代入響應面分析表，并對其進行響應面回歸分析，得到模型的預測值，見表2。

表2 響應面優(yōu)化試驗設計與結果

通過響應面分析對響應值R與自變量A、B、C、D之間的關系進行數(shù)學關系表達，得到擬合的回歸方程模型如下：

R=69.65+0.47×A-0.59×B+0.24×C+0.25×D+0.23×A×B-0.22×A×C-0.092×A×D+0.29×B×C+0.065×B×D+0.095×C×D-1.75×A2-4.40×B2-0.50×C2-0.81×D2

式中：R為剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率(%)；A為初始pH值；B為反應溫度(℃)；C為反應時間(h)；D為SDS投加量(%)。

對上述擬合得到的回歸方程模型進行顯著性檢驗及方差分析，其結果見表3。

由表3可見，該回歸方程模型p<0.000 1，為差異極顯著，失擬項p=0.230 1>0.05，為差異不顯著，說明利用該響應面分析結果擬合得到的回歸方程模型具有顯著意義。

表3 回歸方程模型的顯著性檢驗及方差分析

注：“**”表示顯著性水平為差異極顯著，p<0.01；“*”表示顯著性水平為差異顯著，0.01

相關系數(shù)(R2)和調(diào)整相關系數(shù)(R2Adj)是檢驗模型可信度和準確性的指標，兩者數(shù)值越接近且越接近1，則證明模型的可信度和準確性越高，模型擬合結果越能有效地反映試驗數(shù)據(jù)。本試驗方案中，相關系數(shù)R2=0.963 1和調(diào)整相關系數(shù)R2Adj=0.926 3，表明回歸方程模型對試驗數(shù)據(jù)的擬合情況較好，適用于對SDS促進復合酶水解提取剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率進行分析與預測。通過F值大小可以得出各試驗因素對SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的影響顯著性由強至弱順序為：反應溫度>初始pH值>SDS投加量>反應時間。

為了保證響應面分析所得模型的準確性，通過Design Expert 10軟件對預測值與實測值的誤差進行了更深入的分析，主要通過殘差值的計算來對標準偏差偏離實測值及預測響應值的程度進行表征。圖5為內(nèi)部學生化殘差分布與標準正態(tài)分布的概率關系圖，圖6為內(nèi)部學生化殘差與試驗序號的關系圖，圖7為剩余污泥蛋白質(zhì)提取率實測值與預測值的關系圖。

圖5 內(nèi)部學生化殘差與標準正態(tài)分布的概率關系圖Fig.5 Relationship between the internally studentized residuals and normal probability distribution

圖6 內(nèi)部學生化殘差與試驗序號的關系圖Fig.6 Relationship between the internally studentized residuals and the experimental number

圖7 剩余污泥蛋白質(zhì)提取率實測值與預測值的關系圖Fig.7 Relationship between the actual and the predicted protein extraction rate

由圖5、圖6和圖7可見，本次試驗的數(shù)據(jù)點呈現(xiàn)出線性分布模式，未出現(xiàn)特別明顯的異常點，說明本次響應面回歸分析所得到的二次回歸方程模型具有較為良好的擬合度(見圖5)；本次試驗中涉及的所有數(shù)據(jù)點均呈現(xiàn)出隨機分布狀態(tài)，未發(fā)現(xiàn)任何的分布規(guī)律和變化趨勢，大部分內(nèi)部學生化殘差均分布在±3范圍之內(nèi)，從而更加證明了本次響應面回歸分析所得到的二次回歸方程模型的擬合度具有較高的準確性(見圖6)；本次試驗的所有數(shù)據(jù)點幾乎平均分布于一條直線上，該直線的斜率剛好為1,說明本次響應面回歸分析所得到的預測值與實測的試驗值吻合情況良好，進一步證明本次響應面回歸分析所得到的二次回歸方程模型具有較為良好的擬合度(見圖7)。

2.2.2 各因素對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率影響顯著性的響應面分析

為了更加直觀地觀察初始pH值、反應溫度、反應時間和SDS投加量各因素之間的交互作用對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響，本文繪制了各因素兩兩之間交互作用的三維響應面分析曲面圖，見圖8至圖13。

圖8 初始pH值與反應溫度(T)之間交互作用的三維響 應面分析曲面圖Fig.8 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between initial pH and temperature (T)

圖9 初始pH值與反應時間(t)之間交互作用的三維響 應面分析曲面圖Fig.9 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between initial pH and reaction time(t)

圖10 初始pH值與SDS添加量(W)之間交互作用的 三維響應面分析曲面圖Fig.10 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between initial pH and SDS dosage (W)

圖11 反應溫度(T)與反應時間(t)之間交互作用的 三維響應面分析曲面圖Fig.11 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between reaction temperature (T) and reaction time (t)

圖12 反應溫度(T)與SDS投加量之間交互作用的 三維響應面分析曲面圖Fig.12 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between reaction temperature (T) and SDS dosage (W)

圖13 SDS投加量與反應時間(t)之間交互作用的三維響 應面分析曲面圖Fig.13 Three dimensional surface diagram of response surface analysis of the interaction between SDS dosage and reaction time

由圖8可見，初始pH值與反應溫度之間的交互作用對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響三維響應面分析曲面近似為橢圓，表明因素A與B之間的交互作用對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響較為顯著；而從三維響應面分析曲面的坡度可以看出，反應溫度的影響要大于初始pH值。

同樣，由圖9至圖13可見，因素A與C之間的交互作用對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響較為顯著，初始pH值的影響要大于反應時間；因素A與D之間的交互作用對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響較為顯著，初始pH值的影響要大于SDS投加量；因素B與C之間的交互作用對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響十分顯著，反應溫度的影響要遠遠大于反應時間；因素B與D之間的交互作用對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響十分顯著，反應溫度的影響要遠遠大于SDS投加量；因素C與D之間的交互作用對剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的影響不顯著，SDS投加量的影響要略大于反應時間。

通過圖8至圖13的響應面分析曲面圖，更加直觀地表明了SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)響應面優(yōu)化試驗中，各因素的影響顯著性由強至弱表現(xiàn)為：反應溫度>初始pH值>SDS投加量>反應時間。

2.2.3 驗證性試驗

對響應值R進行最大化計算，計算得到SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的最大值和對應的最優(yōu)提取條件，見圖14。

圖14 響應面法優(yōu)化結果Fig.14 Optimization results of the response surface methodology

根據(jù)對應的編碼值計算，可得到響應面優(yōu)化后的最佳提取條件為：初始pH值A取7.423、反應溫度B取56.887℃、反應時間C取2.606 h、SDS投加量D取8.156%，此時響應值剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率R的最大值為69.739%。

為了驗證模型預測的準確性，按照優(yōu)化后的提取條件，并考慮到試驗過程中各因素控制的精確度影響，在修正條件下(初始pH值為7.4、反應溫度為56.9℃、反應時間為2.6 h、SDS投加量為8.16%)進行了3次重復性驗證試驗，所得剩余污泥蛋白質(zhì)提取率R的平均值為69.12%，與響應面回歸模型所得到的預測值(69.739%)十分接近，說明本次響應面分析所得的回歸模型可以很好地預測實際試驗所得結果，表明通過響應面優(yōu)化得到的SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的工藝條件確實可行，具有實際應用價值。

3 結 論

本文以江蘇省常州市某市政污水處理廠的剩余污泥為原料，將SDS作為添加劑，研究其對復合酶(堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=4∶1)水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的促進作用，并根據(jù)前期試驗結果，在確定液固比為5∶1和復合酶加酶量為5.23%的條件下，以剩余污泥蛋白質(zhì)的提取率為指標，通過SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的相關試驗，主要得到以下結論：

(1) 通過對SDS投加量、反應溫度、初始pH值和反應時間因素進行單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗，確定SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)的最佳提取條件為：液固比5∶1、復合酶加酶量5.23%、初始pH值7.4、反應溫度56.9℃、反應時間2.6 h、SDS投加量8.16%。在該提取條件下剩余污泥蛋白質(zhì)提取率的最大值可達69.12%，比僅使用復合酶的提取率(60.83%)提高了8.29%。

(2) 在首先確定液固比和復合酶加酶量的條件下，通過響應面分析得到SDS促進復合酶水解法提取剩余污泥蛋白質(zhì)各因素的影響顯著性由強至弱表現(xiàn)為：反應溫度>初始pH值>SDS添加量>反應時間。