寧夏地區(qū)雞滑液囊支原體的分離鑒定與藥敏試驗

石曉磊，齊田苗，邊海霞，周云鋒

(1.寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司，寧夏銀川 750021；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

支原體是一類無細胞壁，僅由胞漿膜包裹的介于細菌和病毒之間的原核生物，直徑約為0.1 μm。在固體培養(yǎng)基上可形成“煎蛋樣”菌落[1]，體外培養(yǎng)對營養(yǎng)的要求苛刻。支原體自然感染的宿主范圍廣且具有一定的宿主特異性，主要侵害哺乳動物和禽類的生殖系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，還可引發(fā)乳腺炎、關節(jié)炎及眼部感染[2]。支原體的研究開始于法國Nocard和Roux在1898年首次從患有牛傳染性胸膜肺炎的牛肺組織中分離得到此種微生物，之后相繼從山羊、禽、犬類中分離到此類微生物[3]。近年發(fā)現(xiàn)的支原體已超過100多種，均屬于柔膜菌綱支原體目、支原體科[4]。報道過的對禽有致病性的支原體有28種，其中危害最大的有3種，即雞毒支原體、雞滑液囊支原體和火雞支原體。以雞毒支原體和滑液囊支原體感染最為嚴重[5]。滑液囊支原體可引起雞和火雞的傳染性滑液囊炎、慢性呼吸系統(tǒng)疾病及雞蛋尖端綜合征[6]?；耗抑гw傳染性極強，感染率較高，病雞和隱性感染雞群是該病的傳染源。感染滑液囊支原體會導致雞群的飼料轉(zhuǎn)化率降低，蛋的質(zhì)量也會受到影響，由于發(fā)病雞抵抗力下降，導致死淘率升高[7]。自發(fā)病以來，雞滑液囊支原體病已經(jīng)對寧夏地區(qū)的蛋種雞行業(yè)危害甚大。本試驗通過分離培養(yǎng)當?shù)氐木?，并通過藥敏試驗篩選出幾種敏感藥物，為滑液囊支原體病的藥物治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病料的采集 2017年9月至2017年12月期間，在寧夏地區(qū)養(yǎng)殖場共觀察到了87只具有典型的腿關節(jié)腫脹并伴有慢性呼吸道病癥狀的病雞，無菌采集病雞的跗關節(jié)內(nèi)容物和抓墊內(nèi)容物，經(jīng)過分離培養(yǎng)和鑒定，成功分離到共13株滑液囊支原體菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良Frey氏培養(yǎng)基，北京中海生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 抗菌藥物 酒石酸泰萬菌素，寧夏泰瑞制藥公司產(chǎn)品(批號：E13116906)；延胡索酸泰妙菌素，上海禮來公司產(chǎn)品(批號：B399969)；土霉素，河北健民公司產(chǎn)品(批號：8160773)；磷酸替米考星，寧夏泰瑞制藥公司產(chǎn)品(批號：K81170414)；酒石酸泰樂菌素，寧夏泰瑞制藥公司產(chǎn)品(批號：A91171008)；替米考星，寧夏泰瑞制藥公司產(chǎn)品(批號：H71161122)；氟苯尼考，上海禮來公司產(chǎn)品(批號：C793518)；鹽酸多西環(huán)素，浙江伊科拜克公司產(chǎn)品(批號：170304)；恩諾沙星，四川拜耳制藥(批號：CN36901)。

1.2 方法

1.2.1 采樣部位及分離培養(yǎng) 取發(fā)病初期的病雞腿關節(jié)和抓墊，消毒徹底后取關節(jié)內(nèi)容物置于9 mL改良Frey液體培養(yǎng)基內(nèi)，加蓋后放置在37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每日觀察2次，待培養(yǎng)基顏色變黃后，按1∶10的比例接種到新的培養(yǎng)基中，穩(wěn)定傳代3次后，將培養(yǎng)液接種在改良Frey氏固體培養(yǎng)基，每個平板接種100 μL，涂勻加蓋后放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d～7 d，每天觀察菌落的生長情況，待肉眼可見固體培養(yǎng)基上有菌落生長，置低倍顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)中央凸起呈荷包蛋樣的典型支原體菌落，挑取單個菌落到新的液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)48 h后菌液可進行下一步的PCR檢測。

1.2.2 病變關節(jié)腔滲出物的常規(guī)細菌學鑒定 無菌采集病雞的跗關節(jié)液，接種于MHA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)72 h。無菌采病雞喉頭拭子接種于MHA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，染色后觀察細菌形態(tài)。

1.2.3 PCR檢測 根據(jù)OIE推薦的MS檢測引物序列設計了引物，預期擴增片段大小為185 bp。上游引物MS-F:5′-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3′；下游引物MS-R:5′-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′。試劑盒法提取模板DNA，進行PCR擴增。Taq酶購自寶生物(大連)有限公司。PCR體系：10 μL 2×mix，上、下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，加雙蒸水補足20 μL，將以上成分混合后，置于PCR機中，94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃(檢測引物為53℃)退火30 s，72℃延伸1 min；共30個循環(huán)，72℃延伸 10 min。

1.2.4 抗菌藥物的稀釋 無菌稱取抗菌藥物溶于稀釋液中，無菌操作配制成濃度為10 mg/mL的原液，再用液體培養(yǎng)基將藥液稀釋至1 mg/mL，每種藥物取1 mL,38℃培養(yǎng)3 d觀察有無真菌或細菌污染。

1.2.5 常用抗菌藥物最小抑菌濃度的測定 從寧夏地區(qū)分離鑒定的13株MS，每個分離地隨機選取1株進行MIC(minimal inhibitory concentration)測定。在滅菌EP管中分別加入改良Frey氏液體培養(yǎng)基0.37 mL，每組21個梯度，于每組的第1管依次分別加入上述稀釋并除菌的抗生素各0.37 mL，然后按1∶1倍比稀釋至第21管后棄去多余的0.35 mL，接著各孔加入40 μL待測菌液。第22管作為陰性對照(培養(yǎng)基0.3 mL)，第23管作為藥物對照(培養(yǎng)基2 mL+抗生素0.5 mL)，第24管(培養(yǎng)基2 mL+200 μL待測菌液)不加抗生素作陽性對照。稀釋好的菌-藥液移至96孔細胞培養(yǎng)板上，加蓋后置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d觀察結(jié)果，結(jié)果判定標準：第22管和23管不變色，24管由原來的紅色變?yōu)辄S色且清澈透明，讀取試驗孔的顏色變化，記錄無滑液囊支原體生長的最大稀釋倍數(shù)，根據(jù)藥物稀釋濃度計算菌株的最小抑菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 滑液囊支原體的分離鑒定

2.1.1 常規(guī)細菌學鑒定 剖檢腿關節(jié)腫脹的病雞，用無菌拭子采集關節(jié)腔膿液，涂布在MHA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h未發(fā)現(xiàn)菌落生長。

2.1.2 滑液囊支原體的固體培養(yǎng)和菌落特征 將菌液涂布在改良Frey氏固體培養(yǎng)基平板上，在體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃靜置培養(yǎng)，低倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)第4天有菌落小、光滑、圓形、稍平，并具有一個較致密的中央隆起的呈“煎蛋樣”的菌落(圖1)。

圖1 低倍鏡下的菌落特征(10×10)

2.1.3 常規(guī)細菌分離 用無菌的操作采集雞的病變關節(jié)滲液， 接種于MHA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)72 h，結(jié)果未見菌落生長。

2.1.4 分子生物學診斷 取病變關節(jié)滲出液提取DNA，選擇OIE規(guī)定的檢測引物PCR擴增MS的特異性基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見185 bp左右的特異條帶(圖2)。

M.DNA標準 DL 2 000；1～8.分離株；9.陰性對照；10～14.分離株

M.DNA Marker DL 2 000;1-8.Isolates;9.Blank control;10-14.Isolates

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2 Agarose gel electrophoresis diagram of PCR products

2.2 MIC的測定

選擇最常見的幾種藥物和3株雞滑液囊支原體分離株，測定每種藥物的最小抑菌濃度，MIC結(jié)果見表1，結(jié)果顯示，酒石酸泰萬菌素的敏感性最高，藥物MIC值在0.04 μg/mL左右；泰樂菌素、泰妙菌素敏感性次之，MIC值為0.12 μg/mL～0.22 μg/mL；磷酸替米考星、鹽酸林可霉素大觀霉素、多西環(huán)素，MIC值為1.95 μg /mL～7.81 μg /mL；土霉素和氟苯尼考的敏感性最差，在15.63μg/mL～31.25 μg/mL。

3 討論

盡管雞滑液囊支原體病在寧夏地區(qū)普遍流行，但對本病病原的分離鑒定和相關的研究卻很少，本研究從寧夏地區(qū)感染雞滑液囊支原體病的蛋種雞場采集發(fā)病雞的跗關節(jié)和爪墊并成功分離培養(yǎng)到13個菌落小、光滑、圓形、稍平，并具有一個較致密的中央隆起的呈“煎蛋樣”的菌落[9]。挑取單菌落液體培養(yǎng)，可導致培養(yǎng)基顏色的變化但不渾濁，根據(jù)OIE推薦設計了一對引物，提取分離菌的核酸經(jīng)PCR鑒定為MS陽性，與丁美娟等結(jié)論相符合[10]。

表1 藥物對3株分離株的最小抑菌濃度

本研究改進了傳統(tǒng)的支原體分離方法，滑液囊支原體的分離鑒定周期較長，培養(yǎng)條件也較為苛刻，但結(jié)果可靠準確，并且能進一步進行藥敏試驗，對藥物治療有重要的指導意義。

從每個分離地挑取1個菌株進行常用藥物的藥敏試驗，由于支原體的培養(yǎng)特性，普通的藥敏片法和牛津杯法很難評價藥物的敏感程度，所以選擇更加費時費力的微量液體稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度[8]。選擇泰萬菌素、泰妙菌素、替米考星等藥物，從本試驗結(jié)果看，在酒石酸泰萬菌素等8種抗生素中，MS-NX-2和MS-NX-3這2株雞滑液囊支原體分離株對酒石酸泰萬菌素的MIC值均為0.03 μg/mL，是所選藥物中效果最好的，其次，酒石酸泰樂菌素和延胡索酸泰妙菌素的也有較高的敏感性，土霉素和氟苯尼考對所有分離菌最不敏感。不同菌株對藥物的敏感性存在一定的差異。本研究中NX-2和NX-3對酒石酸泰萬菌素的最低抑菌濃度為0.03 μg/mL，而MS-NX-1分離株對酒石酸泰萬菌素最低抑菌濃度為0.06 μg/mL，此試驗證實了這一點。因此，當雞場發(fā)生雞滑液囊支原體病時，及時分離菌株，通過測定藥物的最小抑菌濃度有助于藥物的選擇。