水皰性口炎病毒免提取核酸熒光定量PCR鑒別檢測(cè)方法的建立

張彩虹，林彥星，楊俊興，曹琛福，呂建強(qiáng)，黃超華，祁振強(qiáng)，林慶燕，花群義*

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045；2.深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳 518101)

水皰性口炎(Vesicular stomatitis,VS)是由水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)引起的一種重要的人畜共患傳染病，在我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄中列為二類傳染病[1-2]。馬、牛和豬是易感動(dòng)物，綿羊、山羊和其他野生動(dòng)物也可被感染。易感動(dòng)物染病后臨床癥狀與口蹄疫、豬水皰性皮疹以及豬水皰病很難區(qū)分，因而實(shí)驗(yàn)室診斷需要對(duì)這幾種傳染病進(jìn)行鑒別診斷[3]。VSV分為2個(gè)血清型，即印第安納型(VSV-IND)和新澤西型(VSV-NJ)。VSV為單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約11 kb，依次排列著N、NS、M、G和L 5個(gè)基因，分別編碼核蛋白、磷蛋白、糖基化蛋白、糖蛋白和RNA聚合酶蛋白。水皰性口炎的存在與流行直接影響人類及動(dòng)物健康，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國(guó)進(jìn)口動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品貿(mào)易量的不斷增長(zhǎng)，水皰性口炎傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)不容忽視，一旦傳入將會(huì)給我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失，因此建立快速高效的鑒別診斷方法對(duì)防止該病傳入具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

熒光定量PCR方法是將PCR與熒光檢測(cè)結(jié)合起來，具有高度的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病診斷領(lǐng)域。直擴(kuò)熒光定量PCR方法是利用一類經(jīng)過基因工程改造的高耐受的TaqDNA聚合酶，這類酶可以直接以全血、血清、尿液、水皰液、糞便、牛奶、動(dòng)物組織等材料為模板，無需經(jīng)過核酸提取的步驟，經(jīng)一步PCR擴(kuò)增到目的基因，從而顯著簡(jiǎn)化檢測(cè)流程，節(jié)省時(shí)間和成本，提高檢測(cè)效率。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種檢測(cè)VSV核酸的PCR或熒光定量PCR方法[4-12]，本研究團(tuán)隊(duì)也建立了一種可同時(shí)鑒別檢測(cè)VSV-IND和VSV-NJ的二重?zé)晒舛縋CR方法[13]。但目前還沒有檢測(cè)VSV直擴(kuò)熒光定量PCR方法的報(bào)道，本研究以VSV兩種血清型編碼病毒RNA聚合酶的L基因?yàn)榘行蛄校謩e設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了一種鑒別檢測(cè)水皰性口炎病毒印第安納型和新澤西型的直擴(kuò)熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 水皰性口炎病毒IND型和NJ型滅活抗原從美國(guó)國(guó)家獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室(NVSL)引進(jìn)，由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存；FMDV O型疫苗株從云南保山疫苗廠引進(jìn)；豬水皰病病毒(SVDV)、藍(lán)舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和豬瘟病毒(CSFV)的滅活抗原均由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 病毒RNA抽提試劑盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit (AM1836)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Direct One-Step S/P qPCR Taqprobe Kit購(gòu)自美國(guó)VitaNavi公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針 本文中所用到的引物和探針序列引用于本研究團(tuán)隊(duì)林彥星等所建立的鑒別檢測(cè)VSV-IND和VSV-NJ的熒光定量PCR方法[13]，特異性擴(kuò)增水皰性口炎病毒編碼病毒RNA聚合酶的L基因，引物與探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 直擴(kuò)熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立 采用直擴(kuò)熒光定量PCR試劑盒，在25 μL反應(yīng)體系中包含以下成分：2×S/P qPCR mix、25×S/P qPCR Polymerases、模板、VSV-IND引物和探針(10 μmol/L)或VSV-NJ引物和探針(10 μmol/L)、Rox Reference Dye、DEPC水。應(yīng)用矩陣法對(duì)引物和探針的使用濃度進(jìn)行篩選，以獲得最佳的擴(kuò)增效果。

表1 VSV-IND和VSV-NJ L基因的引物和探針序列

本試驗(yàn)在ABI 7500熒光PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和CT值判定結(jié)果。VSV-NJ的反應(yīng)結(jié)果在FAM通道檢測(cè)，VSV-IND的檢測(cè)結(jié)果在HEX通道檢測(cè)。

1.2.3 直擴(kuò)熒光定量PCR方法的特異性試驗(yàn) 采用直擴(kuò)熒光定量PCR方法，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件，分別以VSV-IND、VSV-NJ、FMDV、SVDV、BTV、EHDV、PPRV、BVDV和CSFV的滅活抗原和BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)液為模板，對(duì)該方法的特異性進(jìn)行評(píng)估。

1.2.4 直擴(kuò)熒光定量PCR方法的敏感性試驗(yàn) 將VSV-IND和VSV-NJ的滅活抗原進(jìn)行10倍系列稀釋，采用已優(yōu)化的直擴(kuò)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)該方法的敏感性進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)與常規(guī)的熒光定量PCR[13]進(jìn)行比較。

1.2.5 直擴(kuò)熒光定量PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn) 分別采用等量的4份不同濃度梯度的模板進(jìn)行直擴(kuò)熒光定量PCR試驗(yàn)，每份模板每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，以確定該方法的組內(nèi)差異。在不同的時(shí)間段對(duì)4份不同濃度梯度的模板進(jìn)行3次直擴(kuò)熒光定量PCR試驗(yàn)，以確定該方法的組間差異。

1.2.6 臨床樣品的檢測(cè) 采用本研究所建立的方法，對(duì)本室保存的200份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并分別以VSV-IND和VSV-NJ滅活抗原為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)用本室建立的雙重?zé)晒釶CR方法[13]進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 直擴(kuò)熒光定量PCR方法的建立

通過對(duì)VSV-IND和VSV-NJ引物和探針濃度的優(yōu)化，最終確定25 μL反應(yīng)體系，2×S/P qPCR mix 12.5 μL，25×S/P qPCR Polymerases 1 μL，正反向引物各1 μL，探針0.5 μL，模板5 μL，Rox Reference Dye 0.5 μL，DEPC水 3.5 μL。熒光定量PCR循環(huán)條件為：55℃ 30 min，95℃ 5 min，然后94℃ 20 s，60℃ 40 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，VSV-NJ在FAM通道進(jìn)行結(jié)果分析，VSV-IND在HEX通道進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果顯示，以VSV-IND和VSV-NJ滅活抗原為模板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)分別在HEX和FAM通道出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)液、空白對(duì)照無擴(kuò)增，且VSV的兩個(gè)血清型之間無交叉反應(yīng)，即HEX通道只有VSV-IND滅活抗原出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線；FAM通道只有VSV-NJ滅活抗原出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線(圖1)。

2.2 直擴(kuò)熒光定量PCR 的特異性試驗(yàn)

采用已優(yōu)化的直擴(kuò)熒光定量PCR反應(yīng)體系，分別以VSV-IND、VSV-NJ、FMDV、SVDV、BTV、EHDV、PPRV、BVDV和CSFV的滅活抗原和BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)液為模板，進(jìn)行直擴(kuò)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在FAM通道，只有VSV-NJ樣品呈典型的陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)；在HEX通道，只有VSV-IND樣品呈陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)，其他病毒對(duì)照和BHK細(xì)胞對(duì)照均呈陰性反應(yīng)(圖2)，表明所建立的方法特異性好，能準(zhǔn)確鑒別檢測(cè)VSV-IND和VSV-NJ，且與其他能引起相似癥狀的病毒樣品無交叉反應(yīng)。

A.VSV-IND擴(kuò)增曲線圖(HEX)；B.VSV-NJ擴(kuò)增曲線圖(FAM)A.Amplification curve of VSV-IND (HEX); B.Amplification curve of VSV-NJ (FAM)

A.VSV-IND特異性結(jié)果(HEX)；B.VSV-NJ特異性結(jié)果(FAM)A.Specificity result of VSV-IND (HEX); B.Specificity result of VSV-NJ (FAM)

2.3 直擴(kuò)熒光定量PCR 的敏感性試驗(yàn)

結(jié)果顯示，建立的直擴(kuò)熒光定量PCR方法對(duì)VSV-IND和VSV-NJ滅活抗原的檢測(cè)靈敏度均為10-5(圖3)，而常規(guī)的熒光PCR對(duì)同一份樣品的檢測(cè)靈敏性也為10-5，該方法的檢測(cè)靈敏性與傳統(tǒng)的先提核酸再進(jìn)行熒光定量PCR[13]的靈敏性相當(dāng)，說明所建立的方法具有良好的檢測(cè)靈敏度。

A.VSV-IND敏感性結(jié)果(HEX)；B.VSV-NJ敏感性結(jié)果(FAM)A.Sensitivity result of VSV-IND (HEX); B.Sensitivity result of VSV-NJ (FAM)

2.4 直擴(kuò)熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)

VSV-IND和VSV-NJ分別選取4個(gè)稀釋度的滅活抗原進(jìn)行直擴(kuò)熒光定量PCR，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，根據(jù)Ct值計(jì)算變異系數(shù)(CV)。組內(nèi)變異試驗(yàn)結(jié)果顯示，VSV-IND檢測(cè)的變異系數(shù)為0.29%～1.14%，VSV-NJ檢測(cè)的變異系數(shù)為0.24%～1.83%；組間變異試驗(yàn)結(jié)果顯示，VSV-IND檢測(cè)的變異系數(shù)為1.62%～2.12%，VSV-NJ檢測(cè)的變異系數(shù)為0.85%～1.92%，表明該方法重復(fù)性好(表2和圖4)。

表2 檢測(cè)VSV-IND和VSV-NJ的直擴(kuò)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

分別用建立的直擴(kuò)熒光定量PCR方法和常規(guī)的二重?zé)晒釶CR方法對(duì)200份豬血臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，直擴(kuò)熒光定量PCR方法僅陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，200份臨床樣品均無特異性擴(kuò)增曲線，該結(jié)果與常規(guī)二重?zé)晒釶CR結(jié)果一致。

3 討論

本研究采用一種新型的TaqDNA聚合酶，建立了一種無需提取核酸，直接從樣品中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的可快速鑒別檢測(cè)VSV-IND和VSV-NJ的直擴(kuò)熒光定量PCR方法。

在傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法中，由于其DNA聚合酶的活性受各種各樣樣品(如血液、動(dòng)植物組織、飼料、食物)中抑制因子(如血紅蛋白、高鐵血紅素、乳鐵蛋白等)的影響，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，必須先從待測(cè)樣本中分離純化核酸。目前雖然有多家公司推出了自動(dòng)或半自動(dòng)的核酸提取工作站，顯著節(jié)省了人力成本，但核酸提取的費(fèi)用顯著增加，尤其是很多基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室難以配備價(jià)格昂貴的全自動(dòng)核酸提取儀。而直擴(kuò)熒光定量PCR法則避免了這一難題，該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是采用高耐受性的DNA聚合酶，無需提取核酸，可直接從樣品中擴(kuò)增目的基因，從而簡(jiǎn)化了PCR的步驟，克服了傳統(tǒng)熒光定量PCR中存在的成本高、效率低、易造成交叉污染等問題。目前該方法已經(jīng)應(yīng)用于動(dòng)物疫病病原的檢測(cè)[14-15]。

特異性、敏感性和檢測(cè)速度是考查熒光定量PCR的3項(xiàng)重要指標(biāo)，本研究設(shè)計(jì)的引物和探針特異性良好，不僅可以鑒別檢測(cè)2種血清型的VSV，而且與其他能引起相似癥狀的病毒無交叉反應(yīng)。就檢測(cè)的敏感性來說，本方法的敏感性與傳統(tǒng)的熒光定量PCR相當(dāng)，對(duì)10倍系列稀釋的VSV-IND和VSV-NJ的滅活抗原檢測(cè)的敏感性均為10-5。在保證了方法的特異性和敏感性的前提下，本方法無需提取核酸，比傳統(tǒng)的熒光定量PCR節(jié)省了提取核酸的時(shí)間、人力和物力，在檢測(cè)速度方面明顯略勝一籌，而且避免了核酸提取過程中可能發(fā)生的污染問題。水皰性口炎為一種外來動(dòng)物疫病，目前國(guó)內(nèi)還未見該病發(fā)生的報(bào)道，因此用該方法對(duì)200份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果均為陰性，與常規(guī)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致。本研究建立的鑒別檢測(cè)VSV-NJ和VSV-IND的直擴(kuò)熒光定量PCR方法，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，為VSV的檢測(cè)、檢疫、食品安全檢驗(yàn)和VSV分子生物學(xué)研究提供了一種新的方法，也為在同一管內(nèi)對(duì)VSV的2個(gè)血清型進(jìn)行直擴(kuò)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)研究奠定了基礎(chǔ)。