表達豬瘟病毒E2和豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白重組腺病毒動物免疫保護試驗

華思紅，熊貝佳，樊鈺瑩，孫永科，楊玉艾

(云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南昆明 650201)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種急性、熱性、致死性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成極大的損失[1]。E2蛋白是豬瘟病毒的主要保護性抗原，能誘導機體產生高水平的特異性中和抗體，保護豬抵抗致死量CSFV的攻擊，在新型疫苗的研發(fā)上發(fā)揮著重要作用[2]。以CSFV E2基因為靶基因的基因工程疫苗的研究取得了良好的進展，如Sun Yuan等用CSFV E2基因構建的腺病毒/甲病毒復制子嵌合載體豬瘟疫苗rAdV-CSFV-E2免疫試驗兔和豬，均可產生較高的CSFV特異性中和抗體，提供完全保護[3]。Wu Chi-ming等將E2基因與桿狀病毒重組，并在昆蟲細胞中表達的E2可以保護接種豬免受強毒的攻擊[4]。郭抗抗等用豬瘟病毒Shimen株E2基因構建的“自殺性” DNA疫苗重組質粒pSCA1-E2免疫小鼠后能產生較高水平的淋巴細胞刺激指數，免疫豬可檢測到抗CSFV特異性血清抗體[5]。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱“豬藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，感染PRRSV可引起大批妊娠母豬流產和仔豬的高死亡率，嚴重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[6]。PRRSV的結構蛋白分別為GP2、GP3、GP4、GP5、M蛋白以及N蛋白，分別由病毒基因組ORF2～7編碼[7]。GP5蛋白由ORF5基因編碼，是PRRSV的主要結構蛋白，可以誘導機體產生中和抗體和誘導細胞凋亡，在病毒的吸附和穿入、生物合成與組裝和誘發(fā)T細胞的增殖應答過程中都發(fā)揮著重要作用，對于研制重組亞單位疫苗及核酸疫苗有重要意義[8]。曹亮等通過重組病毒分別表達GP3、GP5及共表達GP3-GP5蛋白，免疫小鼠后顯示出良好的免疫原性[9]。許信剛等用PRRSV主要保護性抗原基因ORF5構建的重組疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5)免疫小鼠和豬體后，能夠誘發(fā)特異性細胞免疫和體液免疫反應[10]。

本研究將CSFV E2和PRRSV GP5基因串聯，克隆到腺病毒穿梭載體上，經轉染獲得了表達E2和GP5蛋白的重組腺病毒rAd-E2-GP5。通過豬體免疫保護試驗，從臨床癥狀、抗體水平、免疫攻毒保護水平及病理學變化等方面綜合評價rAd-E2-GP5的免疫保護效果，以期為CSFV和PRRSV聯合疫苗的研發(fā)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 表達CSFV E2和PRRSV GP5基因重組腺病毒rAd-E2-GP5為云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院分子生物學實驗室前期構建；PRRSV減毒活疫苗(TJM-F92株，瑞蘭安)購自碩騰(上海)企業(yè)管理有限公司(批號：1504004，1504019)，有效期1年；豬瘟兔化弱毒疫苗(豬瘟脾淋苗)由青島易邦生物工程有限公司惠贈(批號：201607，201608)，有效期1年。

1.1.2 毒株 攻毒用豬瘟病毒強毒為云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院分子生物學實驗室保存血毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒強毒由云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院預防實驗室尹格芬老師惠贈。

1.1.3 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker(DL1000、DL2000)均購自寶生物工程(大連)有限公司；反轉錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit)購自羅氏公司；瓊脂糖購自Biotopped公司；Trizol、氯仿、異丙醇、無水乙醇、丙烯酰胺(SDS)購自西隴化工股份有限公司。

1.1.4 試劑盒 豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒和豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司。

1.1.5 試驗用動物 35頭34日齡～38日齡的健康斷奶仔豬，購自云南玉溪某豬場，該豬場近2年未出現PRRS和CSF疫情，所挑選試驗豬未經PRRS和CSF疫苗免疫，試驗前采集血樣進行PRRSV和CSFV ELISA抗體及RT-PCR抗原檢測，均為陰性。試驗地點為云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院動物房。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 將35頭未免疫陰性豬隨機分為7組(表1)，每組5頭，1、2、3組每頭接種2 mL劑量為1×108TCID50的rAd-E2-GP5，4、5、6組接種PRRS、CSF、PRRS+CSF商品苗，使用按說明書進行，7組接種DMEM，所有組試驗豬免疫途徑均為頸部肌肉注射，均在一免后21 d以相同的途徑和劑量再次免疫，二免后21 d攻毒，1、4組和7組中2頭攻3×105.5TCID50PRRSV強毒，攻毒方式為每頭鼻滴2 mL，肌肉注射1 mL；2、5組和7組中2頭攻4×103TCID50CSFV強毒，攻毒方式為每頭鼻滴2 mL，肌肉注射2 mL；3、6組和7組中1頭攻3×105.5TCID50PRRSV+4×103TCID50CSFV強毒。

1.2.2 體溫檢測及臨床觀察 攻毒后每天早上用溫度計測量所有豬直腸溫度，繪制體溫曲線；每日觀察各組豬的精神、采食、飲水、糞便和發(fā)病情況，記錄臨床癥狀。

1.2.3 體重測量 免疫接種后每周測量體重，觀察各組之間體重增長情況。

1.2.4 豬血清抗體的檢測 在一免第0、7、14、21天、二免后第7、14、21天及攻毒后第7、14天于豬前腔靜脈采集每頭豬血液，按常規(guī)方法無菌分離血清，采用科前的CSFV抗體ELISA檢測試劑盒和PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒分別檢測CSFV和PRRSV抗體，具體操作和結果判定按試劑盒說明書進行。豬繁殖與呼吸綜合征KQ≥20判為陽性，KQ<20判為陰性；豬瘟阻斷率≤30%判為陰性，≥40%判為陽性，在30%～40%判為可疑。

1.2.5 引物設計和組織中病毒核酸檢測 根據CSFV E2基因和PRRSV GP5基因的序列，使用分子生物學軟件Primer Premier 5設計引物。CSFV上游引物為：5′-GAATCTGGTGGGTCCCTC-3′，CSFV下游引物為：5′-GTTACCCTCACCTCCTTGG-3′，擴增長度294bp；PRRSV上游引物為：5′-CCATTCTGTTGGCAATTTGA-3′，PRRSV下游引物為：5′-GGCATATATCATCACTGGCG-3′，擴增長度716 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，使用濃度為50 μmol/L。

無菌采集試驗過程中病死豬以及試驗結束時處死豬的淋巴結、脾臟、肺臟、腎臟、肝臟、心臟于自封袋中，用生理鹽水配300 mL/L甘油浸泡保存，用Gibico公司的Trizol Reagent試劑提取其總RNA，用以上引物進行RT-PCR檢測組織中CSFV和PRRSV的有無情況。

1.2.6 剖檢記錄 對試驗致死豬剖檢并記錄病理變化，攻毒后15 d處死所有存活試驗豬，剖檢并記錄。

1.2.7 攻毒保護率 攻毒后主要從有無豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征臨床癥狀、體溫反應、剖檢病理變化、存活率等方面進行評價，統計攻毒保護率。

表1 試驗設計

2 結果

2.1 臨床癥狀

1組(rAd-E2-GP5 1組)和3組(rAd-E2-GP5 3組)攻毒后均有4頭臨床發(fā)病，攻毒后第2天體溫升高至41℃以上，精神沉郁，食欲減退甚至廢絕，被毛無光澤，消瘦，全身發(fā)紅，出現結膜炎，全身發(fā)紅，氣喘，部分豬有咳嗽、耳尖發(fā)紺、后肢站立不穩(wěn)，在攻毒后第11～14天開始體溫下降。每組均有1頭精神狀態(tài)良好，無臨床表現。

2組(rAd-E2-GP5 2組)和5組(豬瘟脾淋苗組)整體試驗豬精神狀態(tài)良好，未出現異常。

4組(PRRSV減毒活疫苗免疫組)和6組(PRRSV減毒活疫苗+豬瘟脾淋苗免疫組)攻毒后均有1頭臨床發(fā)病，攻毒后第3天體溫升高，超過41℃，精神沉郁，食欲減退，持續(xù)6 d～10 d后體溫逐漸下降，后期呼吸困難、體表發(fā)紅、精神萎靡。每組中的另外4頭精神狀態(tài)良好，無臨床表現。

7組(空白對照組)高熱稽留，出現典型的CSF和PRRS癥狀，攻毒后6 d～8 d全部死亡。

2.2 體溫檢測結果

攻毒后，商品苗對照組和重組腺病毒豬瘟攻毒組體溫均在正常范圍內，無顯著差異(P>0.05)；重組腺病毒豬藍耳病攻毒組和同時攻豬瘟、豬藍耳病組與商品苗對照組在攻毒后1 d體溫升高至40℃以上，稽留不下，于攻毒后13 d降至正常值，但明顯好于空白對照組，直腸溫度變化見圖1。

2.3 體重變化

免疫期間所有試驗豬體重均成穩(wěn)定上升趨勢，無顯著差異(P>0.05)，攻毒后，重組腺病毒組單獨攻CSFV組和脾淋苗對照組仍穩(wěn)定上升，PRRSV減毒活疫苗組、PRRSV減毒活疫苗+豬瘟脾淋苗免疫組無差異，重組腺病毒PRRSV攻毒組、CSFV+PRRSV攻毒組和空白對照組體重下降(圖2)。

圖2 體重變化曲線

2.4 疫苗免疫和攻毒后豬抗體水平變化

從圖3和圖4可看出，商品苗對照組PRRSV特異性抗體在二免后21 d快速上升，攻毒后KQ值高達101.74；而重組腺病毒組在免疫期間PRRSV特異性抗體值為陰性，攻毒后稍有上升。重組腺病毒組一免后14 d、商品苗對照組一免后21 d，CSFV特異性抗體呈現逐漸上升趨勢；而空白對照組均未檢出抗PRRSV特異性抗體和抗CSFV特異性抗體。提示rAd-E2-GP5具有激發(fā)免疫豬產生針對CSFV的特異性抗體的作用，但不具有激發(fā)免疫豬產生針對PRRSV的特異性抗體的作用。

2.5 攻毒后組織PRRSV和CSFV核酸檢測

結果表明，重組腺病毒組和商品苗對照組各組織中均未檢測到CSFV，空白對照組攻CSFV的所有試驗豬中檢測到了CSFV。重組腺病毒組PRRSV、CSFV+PRRSV攻毒組4/5檢測出PRRSV，PRRSV減毒活疫苗組和豬瘟脾淋苗+PRRSV減毒活疫苗免疫攻毒組1/5檢測出PRRSV，空白對照組攻PRRSV的所有試驗豬中檢測到了PRRSV(表2、表3)。

圖3 ELISA檢測PRRSV抗體水平

圖4 ELISA檢測CSFV抗體水平

組別Groups組號№臟器名稱 Organ name心臟Heart肝臟Liver脾臟Spleen肺臟Lung腎臟Kidney頜下淋巴Submandibular lymph腹股溝淋巴Inguinallymph重組腺病毒組 Recombinant adenovirus group10/50/50/50/50/50/50/520/50/50/50/50/50/50/530/50/50/50/50/50/50/5商品苗對照組 Commercial vaccine group40/50/50/50/50/50/50/550/50/50/50/50/50/50/560/50/50/50/50/50/50/5DMEM73/53/53/53/53/53/53/5

表3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒在各器官中RT-PCR的檢測結果

2.6 病理剖檢結果

1組(rAd-E2-GP5 1組)和3組(rAd-E2-GP5 3組)攻毒后5頭均出現眼觀病變：脾臟腫大，呈暗紫色，有出血點，邊緣有梗死；腎臟有大小不一彌散性出血點，剖開腎乳頭和腎盂有明顯出血點；肺臟腫大，有淤血，呈肉變；淋巴結腫大；膀胱和胃有出血點。2組(rAd-E2-GP5 2組)2頭、5組(豬瘟脾淋苗免疫組)3頭，淋巴結腫大，膀胱、胃和脾臟邊緣有出血點。其余未見異常。4組(PRRSV減毒活疫苗免疫組)3頭、6組(PRRSV減毒活疫苗+豬瘟脾淋苗免疫組)4頭有眼觀病變，淋巴結腫大有出血點；腎臟有出血點；肺臟腫大，有出血點，有輕微炎性變化，少數有斑塊狀實變區(qū)。其余未見異常。7組(空白對照組)所有試驗豬表現出典型的PRRS和CSF病理變化。

2.7 疫苗保護率

空白對照組在攻毒后6 d～8 d全部死亡，期間體溫高熱稽留，表現典型的PRRS和CFS癥狀，剖檢組織病變嚴重；重組腺病毒組CSFV攻毒組和豬瘟脾淋苗對照組臨床上均得到5/5保護，剖檢分別2/5頭、3/5頭有眼觀病變；重組腺病毒組PRRSV、PRRSV+CSFV攻毒組臨床上1/5保護，剖檢5/5頭有眼觀病變；商品苗對照組PRRSV、PRRSV+CSFV攻毒組臨床上4/5保護，剖檢分別4/5頭、3/5頭有眼觀病變(表4)。

3 討論

豬瘟和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病率和病死率都非常高，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的兩大主要烈性傳染病，均給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經濟損失，疫苗免疫是控制這兩種疫病的主要措施[11]。好的疫苗可以降低疫病的發(fā)生和疫病風險，保證養(yǎng)豬業(yè)正常健康的發(fā)展。但PRRSV和CSFV的免疫抑制性，多次抓豬引起的應激反應等原因都會影響疫苗的免疫效果，導致免疫失敗[12]。聯苗的使用在動物疫病防控中越來越受到人們的重視。碩騰(上海)企業(yè)管理有限公司研發(fā)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟二聯活疫苗(TJM-F92株+C株)2016年在中國上市，實驗室報告結合臨床試驗表明該疫苗安全性和保護性都較好[13]。

表4 攻毒保護率統計結果

高飛等基于高致病性PRRSV細胞致弱株HuN4-F112的反向遺傳操作平臺，將CSFV強毒株的E2基因插入PRRSV基因組ORF1b和ORF2之間，構建的重組病毒rPRRSV-E2免疫仔豬后無臨床表現，能夠誘導機體產生針對PRRSV的抗體和高水平的CSFV的中和抗體[14]。研究表明，聯苗的使用可以突破臨床上兩種病毒疫苗同時使用所造成的相互影響，減少免疫次數，達到“一針防兩病”的效果。

本研究結合前人研究的載體基礎[15]，將CSFV和PRRSV的主要保護性基因串聯，構建了重組腺病毒rAd-E2-GP5。本試驗的豬體免疫攻毒保護試驗結果顯示，重組腺病毒組CSFV攻毒組和脾淋苗對照組攻毒后體重穩(wěn)定上升，體溫正常，無臨床表現，剖檢后組織中未檢測到CSFV核酸，說明rAd-E2-GP5在豬免疫攻毒保護試驗中起到保護作用(5/5)。重組腺病毒組PRRSV、PRRSV+CSFV攻毒組攻毒后出現高熱(4/5)，對應豬表現臨床癥狀(4/5)，用RT-PCR檢測到對應豬PRRSV陽性(4/5)，說明rAd-E2-GP5在豬免疫攻毒保護試驗中起到一定的保護作用(1/5)。ELISA檢測抗體水平，重組腺病毒組在免疫期間PRRSV抗體值為陰性，在攻毒后才上升，與商品苗對照組有明顯差異(P<0.05)，CSFV抗體一免后14 d開始穩(wěn)定上升，與脾淋苗對照組無顯著差異(P>0.05)，說明重組腺病毒免疫豬體后能高效誘導機體產生CSFV特異性體液免疫應答，但不能有效誘導PRRSV特異性體液免疫應答。在剖檢中發(fā)現部分未表現臨床癥狀的豬只內臟器官也出現了輕微眼觀病變，這可能是攻毒劑量太大和攻毒力太強導致的。從本試驗結果來看，rAd-E2-GP5能保護致死量的CSFV、PRRSV、CSFV+PRRSV強毒的攻擊，但大部分豬有臨床癥狀和病理變化，在后續(xù)研究中，還需進一步加強重組疫苗對PRRS保護效果的研究，以期能研制出更好的CSFV、PRRSV重組二聯苗。