黑豆中多酚類物質(zhì)的提取及抗氧化活性檢測(cè)

◎ 任夢(mèng)瑤，汪莎莎，高 涵，于海坤，陳 玲，王冰玉，楊延存

（青島工學(xué)院，山東 青島 266300）

植物多酚（Plant polypheno1）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多酚類物質(zhì)[1]，在植物中的含量?jī)H次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，主要存在于植物的皮、根、木、葉、果中。植物多酚在自然界的儲(chǔ)量非常豐富，含多酚較多的常見植物超過600種，在某些針葉樹皮中多酚含量達(dá)20%～40%，僅此，每年在全球形成了數(shù)以億噸的可再生綠色資源。天然抗氧化劑主要來源于植物多酚[2]，而且，研究表明，植物多酚含量及種類與抗氧化性功效有關(guān)。黑大豆是我國珍稀的優(yōu)異糧油作物資源，也是較理想的保健食品原料[3]，黑豆含有豐富的維生素、蛋黃素、黑色素及卵磷脂等物質(zhì)[4]。為了提高對(duì)黑豆的利用，本試驗(yàn)擬對(duì)黑豆中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取和檢測(cè)，并進(jìn)一步檢測(cè)其抗氧化能力及提取條件，從而更加全面地挖掘其營養(yǎng)利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑豆，購買于膠州寶龍城市廣場(chǎng)大潤(rùn)發(fā)超市。

1.2 儀器與設(shè)備

750T型多功能粉碎機(jī)（鉑歐五金廠），KH5200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、80-2電動(dòng)離心機(jī)（上海梅香儀器有限公司），722N型分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚提取率的測(cè)定

分別精確量取0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和1.50 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL比色管中，再分別加入3.0 mL福林-酚試劑，搖勻靜置30 s后加入6.0 mL 12%Na2CO3溶液，最后用蒸餾水定容至25 mL，室溫下反應(yīng)2 h，以0樣為空白，在760 nm下測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定結(jié)果，得出多酚提取率計(jì)算回歸方程為A=82.676 C+0.002 3，R2=0.999 5，式中A為樣品吸光度值，C為樣品中多酚提取率。取樣品多酚提取液1 mL，采用和標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測(cè)定樣品中多酚含量，以沒食子酸計(jì)。

1.3.2 多酚DPPH清除作用的測(cè)定[5-6]。

取提取液樣品溶液4 mL于試管中，依次加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，25 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在517 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水做空白。以相同濃度維生素C作對(duì)比。

式中，A1為4 mL樣液+2 mL DPPH對(duì)應(yīng)吸光度值；A2為4 mL樣液+2 mL 95%的乙醇對(duì)應(yīng)吸光度值；A3為4 mL蒸餾水+2 mL DPPH對(duì)應(yīng)吸光度值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)對(duì)不同試劑的預(yù)試驗(yàn)，將黑豆以不同溶劑（30%甲醇、70%甲醇、30%乙醇、70%乙醇、蒸餾水）浸泡，在一定溫度（30、40、50、60 ℃和70 ℃）下水浴，提取一定時(shí)間（1、3、5、7 h和9 h）后，檢測(cè)多酚提取率。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果對(duì)提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溶劑（C）進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，以多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化多酚類物質(zhì)的提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對(duì)于黑豆中多酚提取率的影響

為全面考察溶劑對(duì)于多酚提取率的影響，試驗(yàn)過程對(duì)甲醇溶液、乙醇溶液進(jìn)行了單獨(dú)試驗(yàn)，挑選出最佳的提取濃度，與蒸餾水一起對(duì)原料中多酚進(jìn)行提取比較，分析提取溶劑對(duì)提取率的影響。由圖1可知，在相同條件下，用30%甲醇提取黑豆中多酚類物質(zhì)，提取率最高，其次為蒸餾水與30%乙醇。

圖1 提取溶劑對(duì)于黑豆中多酚提取率的影響圖

2.2 提取溫度對(duì)于黑豆中多酚提取率的影響

由圖2可以看出，當(dāng)溫度較低時(shí)，黑豆中多酚提取率較低，應(yīng)該是較低溫度限制了多酚的析出；當(dāng)提取溫度在60 ℃時(shí)，黑豆中多酚的提取率是最高的；當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，多酚提取率有所下降，應(yīng)是過高的溫度導(dǎo)致提取物變質(zhì)或被空氣迅速氧化。

圖2 提取溫度對(duì)于黑豆中多酚提取率的影響圖

2.3 提取時(shí)間對(duì)于黑豆中多酚提取率的影響

從圖3可以看出，多酚提取率隨提取時(shí)間的增加出現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)。黑豆中多酚提取率在3 h達(dá)到峰值。當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，提取率不高，是溶出時(shí)間不夠造成的；時(shí)間過長(zhǎng)，提取率降低應(yīng)是多酚被緩慢氧化導(dǎo)致。

圖3 提取時(shí)間對(duì)于黑豆中多酚提取率的影響圖

2.4 黑豆中多酚提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)黑豆提取條件正交試驗(yàn)因素水平表如表1所示，結(jié)果如表2所示。

表1 黑豆提取條件正交試驗(yàn)因素水平表

黑豆中多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過正交試驗(yàn)，根據(jù)極差的大小判斷各因素影響黑豆中多酚提取率的主次順序?yàn)锳＞C＞B，即黑豆多酚的提取率最主要影響因素為提取溫度，其次為提取溶劑濃度、最后是提取時(shí)間。按照平均值大小選取最優(yōu)水平為A2B2C2，即提取條件為溫度55 ℃、提取時(shí)間為3 h、浸提溶劑及濃度為30%甲醇溶液。經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)，在該條件下對(duì)黑豆中多酚進(jìn)行提取，提取率達(dá)到0.198 7 mg/g，確為最優(yōu)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.5 黑豆中的多酚粗提液抗氧化能力檢測(cè)

對(duì)黑豆中提取的多酚粗提液進(jìn)行抗氧化能力檢測(cè)。在最佳提取條件下提取，采用DPPH清除率法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示清除率為12.33%。

3 結(jié)論

本研究以黑豆為原料，對(duì)其多酚類物質(zhì)的提取條件及抗氧化活性進(jìn)行研究。試驗(yàn)中對(duì)黑豆中多酚的提取條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，確定抗氧化能力最強(qiáng)時(shí)的提取條件。研究結(jié)果顯示，對(duì)黑豆中多酚類物質(zhì)提取率影響最顯著的是提取溫度，其次為提取溶劑濃度，最后是提取時(shí)間。黑豆中多酚提取率最高的提取條件為：提取溫度55 ℃、提取時(shí)間為3 h、浸提溶劑及濃度為30%甲醇溶液。在最佳提取條件下獲取的粗提液的DPPH清除率為12.33%。