棉花種間遠(yuǎn)緣雜交及F1 真假雜種的SSR鑒定方法研究

蔡小彥，王玉紅，許艷超，周忠麗，王星星，侯玉清，王坤波，劉方

（棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng)455000）

棉花是世界上最重要的天然纖維來(lái)源，也是重要的油料作物之一。我國(guó)是主要的產(chǎn)棉大國(guó)和紡織品出口國(guó)，棉花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位[1]。種間遠(yuǎn)緣雜交是實(shí)現(xiàn)優(yōu)良農(nóng)藝性狀從1個(gè)物種向另1個(gè)物種轉(zhuǎn)移的有效途徑，也是作物遺傳改良的重要途徑。在棉花栽培品種的遺傳改良研究中，通過(guò)棉花遠(yuǎn)緣雜交把野生種質(zhì)資源特有的優(yōu)良性狀進(jìn)行遺傳重組，創(chuàng)制了大量的種間雜種材料并培育出許多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的棉花品種[2-7]。獲得繼承雙親基因的真雜種后代是有目的地開(kāi)展棉花遺傳改良及其他研究的前提和基礎(chǔ)。棉花是常異花授粉植物，人工去雄不徹底常造成后代真、假雜種混雜，因此對(duì)雜交后代的真實(shí)性鑒定十分必要。

雜種鑒定的傳統(tǒng)方法主要有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、同工酶學(xué)以及分子標(biāo)記等方法。形態(tài)學(xué)鑒定的周期較長(zhǎng)，工作量大，對(duì)于形態(tài)差異小的材料鑒定困難，可靠性低。細(xì)胞學(xué)鑒定程序繁瑣，技術(shù)水平要求較高且分辨率不高，對(duì)于染色體短或結(jié)構(gòu)差異較小的個(gè)體難以準(zhǔn)確鑒定。同工酶則由于酶種類(lèi)限制不能反映全部的結(jié)構(gòu)基因的信息，酶切位點(diǎn)少，多態(tài)性水平較低。分子標(biāo)記的發(fā)展，提供了從DNA水平上來(lái)檢測(cè)后代純度的有利工具。其中SSR（Simple sequence repeat）分子標(biāo)記具有在基因組分布廣泛，多態(tài)性高，不受外界環(huán)境、組織類(lèi)別、發(fā)育時(shí)期等條件的影響等諸多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于油菜、花生、大豆、小豆、茄子、葡萄、甘蔗等植物的真、假雜種以及種子純度檢測(cè)工作[8-13]。SSR分子標(biāo)記已廣泛用于棉種純度和雜交種純度鑒定[14-17]及常規(guī)栽培品種的指紋圖譜[18-19]。本研究利用棉花SSR標(biāo)記鑒定不同棉種間多個(gè)遠(yuǎn)緣雜交組合的F1雜種，并通過(guò)田間表型鑒定進(jìn)行驗(yàn)證，以期提高遺傳作圖群體的構(gòu)建效率，減少田間工作量。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試親本材料宿生保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花所南繁中心的國(guó)家野生棉種質(zhì)圃 （海南三亞崖城），2014年10月至2015年6月通過(guò)人工去雄雜交配制多個(gè)種間雜交組合（表1）。2016年1月將獲得的F1種子催芽、營(yíng)養(yǎng)缽育苗，待第1片真葉平展時(shí)移栽到田間，幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)取嫩葉保存于－80℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取。采用改良的CTAB法[20]提取基因組DNA，采用0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和完整性，核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度，將DNA稀釋成30 ng·μL－1左右的工作液備用。

表1 棉花種間不同雜交組合后代真假雜種的鑒定結(jié)果

1.2.2SSR標(biāo)記篩選。SSR分子標(biāo)記來(lái)自基于雷蒙德氏棉序列草圖構(gòu)建的棉花全基因組DNA標(biāo)記圖譜[21]，SSR分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的引物序列信息源于數(shù)據(jù)庫(kù) Cotton Marker Database（http://www.cottonmarker.org/），引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。利用備選的SSR引物對(duì)父、母本進(jìn)行多態(tài)性分析，選擇條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性好的標(biāo)記用于F1雜種鑒定。

1.2.3PCR擴(kuò)增。 PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反應(yīng)體系10 μL，包括5.0 μL的2×Taq Master Mix for PAGE，1.0 μL 30 ng·μL－1的 DNA 模板，0.2 μL 正、反向 SSR 引物（10 μmol·L），3.6 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火45 s,72℃延伸50 s,30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用0.8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色并拍照存檔。

1.2.4田間形態(tài)鑒定及育性調(diào)查。按照取樣編號(hào)，待雜種后代長(zhǎng)至開(kāi)花期進(jìn)行雜種后代的田間性狀及育性調(diào)查。

2 結(jié)果和分析

2.1 親本間SSR標(biāo)記多態(tài)性篩選

利用80對(duì)SSR引物對(duì)30個(gè)種間雜交組合的親本進(jìn)行多態(tài)性分析，共篩選出11對(duì)多態(tài)性引物（表 2），用于 F1雜種鑒定。

表2 11對(duì)多態(tài)性SSR引物的序列

2.2 F1 雜種的分子鑒定

用篩選出來(lái)的多態(tài)性引物檢測(cè)每個(gè)雜交組合的F1植株，每個(gè)雜交組合用至少2對(duì)SSR引物相互驗(yàn)證。在30個(gè)雜交組合中，有22個(gè)雜種組合獲得真雜種后代，8個(gè)雜交組合沒(méi)有獲得真雜種。獲得真雜種的雜交組合，其后代數(shù)量也不盡相同，其中中草1號(hào)×擬似棉、中0316×雷蒙德氏棉等10個(gè)雜交組合的雜交成功率達(dá)到了100%。30個(gè)雜交組合的雜交F1的鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。F1真雜種同時(shí)具有父本和母本雙方的條帶，呈共顯性(圖1)，而假雜種只有來(lái)自母本的擴(kuò)增條帶。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定及育性調(diào)查

對(duì)于種間形態(tài)差異較大的雜交組合，其雜種后代在苗期及蕾期的形態(tài)介于雙親之間，很容易通過(guò)形態(tài)觀(guān)察確定真、假雜種。例如中0316與雷蒙德氏棉的雜種在第1～4片真葉期為心形葉片；至5葉期后，葉片出現(xiàn)1/3淺葉裂，被短密絨毛；到花蕾期性狀更加明顯，雜種后代的花具有紫紅色花基斑。但F1是三倍體，后代不育。中草1號(hào)與雷蒙德氏棉雜種后代的葉片具有草棉的5深葉裂特征，但較母本葉片多毛且厚；花冠顏色和大小介于兩個(gè)親本之間；紫色大基斑；具有嫩黃色花粉，但是花粉敗育，雜種后代不育。后代雜種的形態(tài)學(xué)鑒定與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果完全一致。

圖1 瑟伯氏棉×三裂棉F1 真假雜種鑒定電泳圖

對(duì)于種間形態(tài)差異較小的雜種后代，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定具有較大困難。例如，野生種瑟伯氏棉和三裂棉的形態(tài)相似，只有細(xì)微的差別。其雜種F1很難通過(guò)簡(jiǎn)單的形態(tài)觀(guān)察區(qū)分真假雜種；另外，父母本親緣關(guān)系較近，雜種后代育性良好。因此，對(duì)于父母本形態(tài)學(xué)差異較小的雜交組合的后代需要借助分子標(biāo)記等手段來(lái)鑒定。

3 討論

雜交育種是培育棉花新品種的重要途徑。由于棉花是常異花授粉植物，在自然狀態(tài)下，自花授粉率達(dá)到95%左右[22]。人工去雄不徹底會(huì)導(dǎo)致雜交后代中可能存在一定比例的自交后代，或由于雜交過(guò)程中外來(lái)花粉污染造成后代混雜，有必要對(duì)雜種后代進(jìn)行早期鑒定，提前剔除假雜種后代，提高育種效率，節(jié)約成本。

通過(guò)大量的種間雜交組合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)棉屬不同種間雜交組合獲得真雜種的成功率不同。我們選擇3個(gè)栽培棉種（中草1號(hào)，中亞1號(hào)以及陸地棉中0316）分別與多個(gè)野生種進(jìn)行雜交試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞洲棉（中亞1號(hào)）與雷蒙德氏棉、擬似棉、斯特提棉、比克氏棉和圓葉棉等野生種雜交困難，沒(méi)有獲得雜交后代，雜交成功率為0。然而，陸地棉（中0316）和草棉（中草1號(hào)）與雷蒙德氏棉、擬似棉、圓葉棉等野生種較容易獲得真雜種后代，雜交成功率均達(dá)到100%。草棉和亞洲棉均是二倍體A基因組的栽培種，二者與雷蒙德氏棉的雜交成功率為何有如此大的差異，還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)多個(gè)雜交組合F1進(jìn)行SSR分子標(biāo)記鑒定與全生育期形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，二者互為印證。SSR分子標(biāo)記鑒定方法的優(yōu)勢(shì)是可以在幼苗期提前鑒定真假雜種，而形態(tài)觀(guān)察在幼苗期往往很難看出差別，一般需要到開(kāi)花后才能確定真假雜種。另外，對(duì)于親本表型差異較小的雜種后代，形態(tài)學(xué)鑒定法不太適用。SSR分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，能夠區(qū)分雜合位點(diǎn)和純合位點(diǎn)，并且重復(fù)性及穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)簡(jiǎn)單，理論上采用1對(duì)SSR引物即可完成對(duì)雜種后代的準(zhǔn)確鑒定[11-13]。棉花的大量SSR引物序列已經(jīng)發(fā)表，方便進(jìn)行引物的選擇。另外雷蒙德氏棉、亞洲棉等棉花全基因組測(cè)序完成后，根據(jù)棉花全基因組序列開(kāi)發(fā)了大批量的SSR標(biāo)記，大大豐富了棉花SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)。因此，SSR標(biāo)記可以作為檢測(cè)棉花真假雜種的理想標(biāo)記。