菏澤市2013～2017年手足口病病毒學(xué)監(jiān)測(cè)分析

劉雅娟 劉啟林

[摘要] 目的 探討菏澤市2013～2017年手足口病流行病毒類(lèi)型，為菏澤市手足口病疫情的防控和實(shí)施策略提供科學(xué)依據(jù)。 方法 2013～2017年菏澤市各縣區(qū)手足口病定點(diǎn)醫(yī)療單位收集的臨床診斷病例的糞便或肛拭子標(biāo)本，提取病毒核酸，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行病毒的核酸檢測(cè)；用描述性流行病學(xué)方法分析流行病學(xué)特征。 結(jié)果 2013～2017年共收集樣本2751份，其中陽(yáng)性樣本2294份，陽(yáng)性率為83.39%；EV71陽(yáng)性樣本1111份，陽(yáng)性率為40.39%；CA16陽(yáng)性樣本387份，陽(yáng)性率為14.08%；其他腸道病毒陽(yáng)性樣本796分，陽(yáng)性率為28.93%。2013年、2015年優(yōu)勢(shì)株為EV71；2014年優(yōu)勢(shì)株為CA16；2016、2017年以其他腸道病毒型為優(yōu)勢(shì)株。不同年齡組、性別、季節(jié)分布差異有顯著性（P<0.05）。各年手足口病毒型別分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 2013～2017年菏澤市手足口病流行病毒類(lèi)型從高到低分別是EV71、其他腸道病毒和CA16。EV71是引起重癥病例的主要病原體。在高發(fā)季節(jié)前，應(yīng)加強(qiáng)托幼機(jī)構(gòu)及散居兒童的衛(wèi)生健康教育和防控力度，提前做好低幼兒童的疫苗宣傳及接種工作；強(qiáng)化手足口病監(jiān)測(cè)力度。

[關(guān)鍵詞] 手足口?。粚?shí)時(shí)熒光定量PCR；腸道病毒71型（EV71）；柯薩奇病毒A16型（CA16）；核酸

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）22-0131-05

[Abstract] Objective To investigate the epidemic virus types of hand-foot-and-mouth disease（HFMD） in 2013-2017 in Heze to provide scientific evidence for the prevention and control and implementation strategy of the epidemic situation of HFMD in Heze. Methods Stool or specimens by means of a swab collected from regular medical organizations in every county and district of Heze from 2013 to 2017 were used to extract viral nucleic acid. Viral nucleic acid was tested using real-time fluorescence quantitative PCR. Epidemiological characteristics were analyzed using descriptive epidemiological method. Results 2751 specimens were collected from 2013 to 2017. Out of them， 2294（83.39%） were positive. 1111 （40.39%） were EV71-positive. 387 （14.08%） were CA16-positive. 796 （28.93%） were other-enterovirus positive. Dominant strain in 2013 and 2015 was EV71. Dominant strain in 2014 was CA16. Dominant strain in 2016 and 2017 was other enterovirus. The differences among subgroups of age， sex and season were significant （P<0.05）. The distributions of HFMD virus types in every year were statistically different（P<0.05）. Conclusion The most common HFMD virus type in Heze from 2013 to 2017 was EV71， followed by other enterovirus and CA16. EV71 was the main pathogen which caused severe cases. Before the high-occurrence season， the health education and prevention and control in nurseries and scattered children should be enhanced. The promotion of vaccines and vaccination in young children should be done previously. It is necessary to strengthen the monitoring of HFMD.

[Key words] Hand-foot-and-mouth disease； Real-time fluorescence quantitative PCR； Enterovirus 17 （EV71）； Coxsackie virus A16 （CA16）； Nucleic acid

手足口?。╤and-foot-and-mouth disease，HFMD）是一種由多種腸道病毒引起的傳染病[1]，以5歲以下嬰幼兒的發(fā)病為主，可導(dǎo)致患兒發(fā)熱及手、足等身體多部位出現(xiàn)皰疹，部分患兒甚至?xí)霈F(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如心肌炎、神經(jīng)源性肺水腫等重癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[2]。在我國(guó)，手足口病的流行病原在2O世紀(jì)80年代前后以CA16病毒感染為主，90年代EV71病毒感染逐漸占主導(dǎo)地位[3]。2013年開(kāi)始全國(guó)手足口病的病原出現(xiàn)以其他腸道病毒為主的現(xiàn)象[4]。為了進(jìn)一步了解菏澤市手足口病的病毒型別，現(xiàn)收集，整理并分析2013～2017年菏澤市九個(gè)縣區(qū)手足口病診療定點(diǎn)單位共計(jì)2751例臨床診斷病例標(biāo)本的病毒核酸檢測(cè)結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

根據(jù)《手足口病預(yù)防控制指南（2009版）》[5]中病原學(xué)監(jiān)測(cè)要求，菏澤市各縣（區(qū)）疾控工作人員到手足口定點(diǎn)診療單位采集臨床診斷為手足口病的病例糞便或肛拭子，以衛(wèi)生部2010版《手足口病診療指南》為手足口病例的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。每縣（區(qū)）每月最少需采集5例首次就診的普通病例標(biāo)本，當(dāng)月縣（區(qū)）病例總數(shù)少于5例時(shí)全部采樣。所有重癥和死亡病例均需采樣。2013～2017年菏澤市九縣區(qū)共采集手足口臨床病例糞便或肛拭子標(biāo)本2751份。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 按照《手足口病預(yù)防控制指南（2009版）中病原學(xué)監(jiān)測(cè)要求，采集手足口病病例糞便或肛拭子標(biāo)本，低溫保存并送檢。糞便標(biāo)本取5 g加入含10%氯仿和玻璃珠的PBS提取液的離心管中，劇烈震蕩30 min，4℃ 3000 rpm離心30 min，取上清液待檢；肛拭子標(biāo)本劇烈震蕩10 min后，棄去棉拭子，4℃ 3000 rpm離心30 min，取上清液待檢。處理完成的標(biāo)本立即提取核酸或保存于-20℃。

1.2.2 儀器及試劑 Roche High Pure Viral RNA Kit提取試劑盒（瑞士Roche公司）；Enterovirus type71 real time RT-PCR kit，Coxsackievirus A16 real time RT-PCR kit熒光定量PCR試劑盒（中山達(dá)安基因股份有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI，Step One Plus）。

1.2.3 病毒核酸檢測(cè) 采用Roche High Pure Viral RNA Kit提取標(biāo)本病毒核酸，取標(biāo)本200 μL，加400 μL應(yīng)用液混勻，室溫10 min；混合液加入過(guò)濾管，下接收集管，10000 rpm 離心15 s，棄收集管，換新收集管；加500 μL 試劑Inhibitor Removal Buffer，8000 rpm 離心1 min，棄收集管，換新收集管；加450 μL試劑Wash Buffer，8000 rpm 離心1 min， 棄收集管，換新收集管；再加450 μL試劑Wash Buffer，8000 rpm離心1 min，棄收集管，換新收集管，最后12000 rpm離心10 s，棄收集管，換1.5 mL的EP管；加50 μL的試劑Elution Buffer，室溫平衡1 min，用10000 rpm離心1 min，EP管中即為提取的RNA。Enterovirus type 71 real time RT-PCR kit、Coxsackievirus virus A16 real time RT-PCR kit熒光定量PCR試劑盒配制核酸反應(yīng)擴(kuò)增體系，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。Real Time RT-PCR操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，反應(yīng)如下：50℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 15 s→55℃ 45 s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤38，則判斷為陽(yáng)性；無(wú)典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值>38，則判斷為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Micrsoft Excel 2003創(chuàng)建數(shù)據(jù)表；用描述性流行病學(xué)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析；用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料用率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手足口病病毒學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)2013～2017采集的手足口病病例樣本共2751份進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本2294份，陽(yáng)性率為83.39%（2294/2751）。其中，檢出EV71、CA16、其他腸道病毒陽(yáng)性分別為1111份、387份、其他腸道病毒陽(yáng)性樣本796份，陽(yáng)性率分別為40.39%（1111/2751）、14.07%（3872751）、28.95%（796/2751）。從年份進(jìn)行比較，2013年共檢測(cè)樣本575份，陽(yáng)性樣本499份，陽(yáng)性率86.78%（499/575），病毒學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果由高到低依次為EV71（65.22%，375/575）、其他腸道病毒（20.17%，116/575）和CA16（1.39%，8/575），顯示EV71為2013年優(yōu)勢(shì)病原體。2014年共檢測(cè)樣本533份，陽(yáng)性樣本430份，陽(yáng)性率80.68%（430/533），病毒學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果由高到低依次為CA16（34.33%，183/533）、其他腸道病毒（23.45%，125/533）和EV71（22.89%，122/533），顯示2014年CA16病毒在菏澤市有小范圍暴發(fā)。2015年共檢測(cè)樣本580份，陽(yáng)性樣本502份，陽(yáng)性率86.55%（502/580），病毒學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果為EV71（58.79%，341/580）、其他腸道病毒（26.38%，153/580）和CA16（1.38%，8/580），顯示2015菏澤市手足口病繼續(xù)以EV71為優(yōu)勢(shì)病原體。2016年共檢測(cè)樣本540份，陽(yáng)性樣本474例，陽(yáng)性率（87.78%，474/540），病毒學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果由高到低依次為其他腸道病毒（39.07%，211/540）、CA16（29.81%，161/540）和EV71（18.89%，102/540）。2017年共檢測(cè)樣本526份，陽(yáng)性樣本389例，陽(yáng)性率74.37%（389/526），病毒學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果由高到低依次為其他腸道病毒（36.52%，191/526）、EV71（32.70%，171/526 ）、CA16（5.16%，27/526）。顯示2016、2017年其他腸道病毒是引起菏澤市手足口病的優(yōu)勢(shì)病原體。各年份手足口的陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=52.862，P<0.001）。引起手足口病的病毒型別分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=694.390，P=0.000）。見(jiàn)表1。

2.2 月份分布

將檢測(cè)結(jié)果按發(fā)病月份分析，手足口病全年各月均有檢出，1月、2月發(fā)病構(gòu)成比較低，分別為2.98%（82/2751）、3.96%（109/2751），3月急增，發(fā)病構(gòu)成比為10.8%（297/2751），4～6月為高峰期，4月構(gòu)成比為13.7%（377/2751），5月構(gòu)成比為15.09%（415/2751），6月構(gòu)成比為10.18%（280/2751），7～12月呈緩慢下降趨勢(shì)，發(fā)病構(gòu)成比分別為6.87%（189/2751）、5.67%（156/2751）、4.47%（123/2751）、3.89%（107/2751）、3.56%（98/2751）、2.22%（61/2751）。見(jiàn)圖1。

2.3 性別、年齡分布

男女陽(yáng)性標(biāo)本比例為1.86：1，男1491份，女803份，陽(yáng)性標(biāo)本在不同性別的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.772，P=0.002）。從年齡結(jié)構(gòu)上看，1～歲組和2～歲組標(biāo)本陽(yáng)性率分別為89.10%（875/982）和86.41%（763/883）。其他年齡組感染概率較低，由高到低依次為：3～歲組81.28%（304/374）、0～歲組73.25%（115/157）、4～歲組70.88%（129/182）、5～歲及以上組62.43%（108/173），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=117.255，P=0.000）。

2.4 地區(qū)分布

從九縣區(qū)手足口檢測(cè)陽(yáng)性率比較，不同縣區(qū)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=162.330，P=0.000）。鄄城陽(yáng)性率最高，為93.11%（284/305），其次為定陶，陽(yáng)性率為92.63%（289/312），最低的為曹縣，陽(yáng)性率為64.92%（198/305）；從各縣區(qū)發(fā)病的病原型別來(lái)看，也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=90.802，P=0.000），牡丹區(qū)EV71構(gòu)成比最高，為6.72%（185/2751）；成武縣其他腸道病毒構(gòu)成比最高，為4.03%（111/2751），定陶CA16構(gòu)成比最高，為2.94%（81/2751），見(jiàn)表3、圖2、圖3。

2.5 重癥病例檢測(cè)結(jié)果

在62例重癥患者（其中1例死亡）的標(biāo)本中，55份檢出手足口病毒，陽(yáng)性率為88.71%（55/62）。其中，EV71病毒陽(yáng)性率為82.26%（51/62）；其他腸道病毒陽(yáng)性率為4.84%（3/62）；CA16病毒陽(yáng)性率為1.61%（1/62）。2013年重癥患者陽(yáng)性15例，全部為EV71感染，陽(yáng)性率為78.95%（15/19）；2014年重癥患者陽(yáng)性12例，EV71陽(yáng)性9例，陽(yáng)性率為69.23%（9/13）；2015年重癥患者陽(yáng)性22例，EV71陽(yáng)性21例，陽(yáng)性率為91.3%（21/22）；2016年無(wú)重癥患者；2017年重癥患者陽(yáng)性6例，EV71陽(yáng)性6例，陽(yáng)性率為85.71%（6/7）。不同年份重癥陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.677，P=0.001）。見(jiàn)表4。

3 討論

通過(guò)對(duì)確診樣本的分析，結(jié)果表明2013～2017年菏澤市手足口病病毒優(yōu)勢(shì)株在不斷發(fā)生變化，從陽(yáng)性樣本總量分析，EV71是引起菏澤市手足口的主要病毒型，2014年出現(xiàn)小規(guī)模的CA16的暴發(fā)，2016、2017這兩年其他腸道病毒替代EV71成為優(yōu)勢(shì)病毒株，并且，由其他腸道病毒引起的手足口病病例構(gòu)成比從2013年的23.2%（116/499），上升到2017年的49.01%（191/389），這與全國(guó)其他地市流行情況相類(lèi)似：甘肅省2013～2016年手足口監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，除了2014年以CA16為優(yōu)勢(shì)病毒株，其余3年都是以其他腸道病毒為主，每年流行的其他腸道病毒型別都在變化，主要是CA6、CA10和CA4[7]；2011～2014年河北省手足口病病原構(gòu)成，EV71和CA16感染所占比例總體上呈下降趨勢(shì)，其他腸道病毒所占比例總體上呈上升的趨勢(shì)[8]；2011～2015年廣州市手足口病流行特征分析，同樣在手足口的高發(fā)季節(jié)，EV71和CA16相比其他年份均出現(xiàn)下降，而其他腸道病毒所占比例呈現(xiàn)明顯上升[9]。腸道病毒A組中的CA6、CA10引起手足口病例的報(bào)道逐年增多[10]。由此判斷，其他腸道病毒可能成為未來(lái)引起菏澤市手足口病的優(yōu)勢(shì)病毒，因此在今后手足口病病原學(xué)監(jiān)測(cè)中加大開(kāi)展其他腸道病毒的分型鑒定的力度，有效提高我市手足口病的預(yù)防、控制能力。

菏澤市地處山東省西南部，中緯度地區(qū)，屬暖熱帶季風(fēng)氣候。這種春季干燥多風(fēng)，夏季高溫多雨，冬寒夏熱，春暖秋涼的氣候特征，非常適宜腸道病毒等各種病原微生物的生長(zhǎng)繁殖[11]，因而，菏澤市手足口病的發(fā)病高峰期均在春末夏初之際。3月初氣溫開(kāi)始回升，3～6月的氣溫和空氣濕度為手足口病的傳播創(chuàng)造了適宜的環(huán)境，導(dǎo)致手足口病的高發(fā)[12]。提示，在高發(fā)的4～6月可嘗試將氣溫、濕度、氣壓等可能導(dǎo)致的手足口病激增的氣候條件作為預(yù)測(cè)的指標(biāo)，同時(shí)加強(qiáng)本階段的監(jiān)測(cè)與防控，以防手足口病的暴發(fā)流行。

2013～2017年菏澤市2751例手足口病臨床診斷病例，按照性別和年齡分組，發(fā)現(xiàn)男童組和女童組比例為1.86：1，性別分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，男童的發(fā)病率高于女童，這與男孩的好動(dòng)及與人頻繁接觸相關(guān)[13]。1～歲組和2～歲組手足口病發(fā)病人數(shù)高于其他年齡組，可能與該年齡段兒童的免疫機(jī)制尚未發(fā)育完全有關(guān)，這與其他研究相同[14]。在病毒學(xué)檢測(cè)方面，各縣區(qū)引起手足口的病毒型別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。牡丹區(qū)EV71構(gòu)成比最高，成武縣其他腸道病毒構(gòu)成比最高，定陶縣CA16構(gòu)成比最高。各縣區(qū)標(biāo)本陽(yáng)性率之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，鄄城標(biāo)本陽(yáng)性率最高，其次定陶，曹縣最低。各縣區(qū)出現(xiàn)的差異可能存在多方面的影響因素，可能與各縣區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生條件、人口免疫現(xiàn)狀、病原體構(gòu)成變化等有關(guān)。2013～2017年菏澤市手足口病重癥病例主要由EV71引起，這與其他地市報(bào)道相一致[15]。這可能與EV71病毒感染性強(qiáng)，易引起神經(jīng)毒性，引發(fā)重癥[16]有關(guān)。

本研究為菏澤市針對(duì)性的開(kāi)展手足口病的防治工作指明了方向，對(duì)未來(lái)手足口病病毒學(xué)流行趨勢(shì)的預(yù)測(cè)提供了有效的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。同時(shí)，在未來(lái)的手足口病防治工作中應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)托幼機(jī)構(gòu)、學(xué)校等人員流動(dòng)性大且人口密集地區(qū)的手足口病衛(wèi)生知識(shí)宣傳，加大重點(diǎn)人群的防控力度，加大發(fā)病率高的縣區(qū)的流調(diào)工作力度，在高發(fā)季節(jié)密切關(guān)注氣候等影響條件的變化，及時(shí)開(kāi)展應(yīng)對(duì)工作，同時(shí)加強(qiáng)接種手足口疫苗的宣傳工作，為適齡兒童接種手足口疫苗是預(yù)防手足口病最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段。加強(qiáng)手足口病的病毒學(xué)監(jiān)測(cè)力度，為手足口的預(yù)防與流行做好研判。

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（收稿日期：2018-03-27）