ER陽性乳腺癌中FOXM1和GRP78蛋白表達(dá)與臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性研究*

李海東 ，趙四成 ，李季丹 ，陳 櫞 ，王 健 ，黃向華 ，張一心 ，郭 燕

（1南通市婦幼保健院普外科，江蘇226018；南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2乳腺外科，3病理科）

女性乳腺癌的發(fā)病率已躍居女性癌癥發(fā)病率的第一位，其中ER陽性乳腺癌占所有乳腺癌的75%～80%。盡管ER陽性乳腺癌患者行化療輔助內(nèi)分泌治療效果較好，且總體預(yù)后佳，但仍有部分患者在治療中出現(xiàn)耐藥甚至復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。研究證明FOXM1在癌癥的發(fā)生中與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）有關(guān)[1]，GRP78 在 ER 陽性的乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)[2]，且與EMT有一定的相關(guān)性[3-4]。本研究收集南通大學(xué)附屬婦幼保健院及附屬腫瘤醫(yī)院2007年1月—2011年12月收治的ⅠB期-ⅢA期（pT3N1M0）ER陽性乳腺癌患者60例（腫瘤醫(yī)院40例），旨在探討ER陽性乳腺癌組織中FOXM1和GRP7表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，以及對(duì)ER陽性乳腺癌患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 ⅠB期-ⅢA期（pT3N1M0）ER陽性乳腺癌患者的石蠟組織60例，年齡34～75歲，平均57.4歲。入組條件：（1）女性；（2）術(shù)前均未經(jīng)任何放化療和免疫治療；（3）術(shù)前排除腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能；（4）行乳腺癌改良根治術(shù)的患者，且病理證實(shí)為ER陽性浸潤性乳腺癌?；颊吲R床病理資料見表1，平均無復(fù)發(fā)生存時(shí)間47.19±20.19月。本項(xiàng)目通過所在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑、材料及方法 采用SP法，常規(guī)HE染色明確診斷。兔抗人FOXM1（ab83097）與GRP78（ab32618）多克隆抗體購自Abcam，工作液按1∶100稀釋，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗采購Dako Cytomation，USA，具體方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 根據(jù)著色的深淺評(píng)分，F(xiàn)OXM1或GRP78陰性，細(xì)胞不著色，記0分；弱陽性，細(xì)胞呈淡黃色，記1分；陽性，細(xì)胞呈棕黃色，記2分；強(qiáng)陽性，細(xì)胞呈深棕黃色，記3分。標(biāo)記物敏感性評(píng)價(jià)：2～3分為高表達(dá)，0～1分為低表達(dá)。切片在光鏡（50×）下進(jìn)行圖像分析（IPWIN60圖像熒光分析軟件），每張切片觀察5個(gè)高倍視野，并分別測(cè)量細(xì)胞中FOXM1和GRP78表達(dá)的平均光密度值。評(píng)估方法及標(biāo)準(zhǔn)參照[5-6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，采用Pearson進(jìn)行相關(guān)分析，分析FOXM1和GRP78表達(dá)之間的相關(guān)性；應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析FOXM1和GRP78表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間相關(guān)性；單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析患者的生存差異，單因素回歸分析中的顯著因素進(jìn)一步納入多因素回歸分析；無復(fù)發(fā)生存期（RFS）采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FOXM1和GRP78在ER陽性乳腺癌中表達(dá)及相關(guān)性 60例ER陽性乳腺癌組織中，34例（56.67%）FOXM1高表達(dá)，陽性信號(hào)定位細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，33例（55%）GRP78高表達(dá)，陽性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)呈深褐色，但在癌旁組織中均為低表達(dá)（圖1，表1）。將復(fù)染后的乳腺癌石蠟切片進(jìn)行掃描，F(xiàn)OXM1和GRP78蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的平均光密度值散點(diǎn)圖見圖2，Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者呈中等相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.51，P<0.001）。

圖1 免疫組化檢測(cè)FOXM1和GRP78在ER陽性乳腺癌表達(dá)

圖2 ER陽性乳腺癌GRP78與FOXM1表達(dá)相關(guān)性

2.2 FOXM1和GRP78高表達(dá)與臨床病理相關(guān)性GRP78表達(dá)水平與脈管侵犯、Ki67有關(guān)，F(xiàn)OXM1表達(dá)與組織學(xué)分期（G 期）、脈管侵犯、Ki67、HER-2之間有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 Kaplane-Meier生存分析 FOXM1高表達(dá)與低表達(dá)患者（30.50 m vs 85 m）（圖 3a），GRP78高表達(dá)與低表達(dá)患者（72 m vs 78 m）（圖3b）術(shù)后RFS差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；FOXM1、GRP78共同高表達(dá)與FOXM1、GRP78共同低表達(dá)患者（30.5 m與89.5 m）RFS的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3c，d）。

2.4 FOXM1與GRP78表達(dá)對(duì)術(shù)后5年RFS的影響 單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，患者5年RFS與脈管侵犯（HR=0.456，P=0.044）、FOXM1 高表達(dá)（HR=0.362，P=0.004）、GRP78 高表達(dá)（HR=0.379，P=0.012）、Ki67高表達(dá)（HR=0.334，P=0.016）、HER2高表達(dá)（HR=10.07，P＜0.001）有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步多因素回歸分析顯示，患者5年RFS與患者HER-2表達(dá)（HR=6.091，P=0.003）有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 2。

表1 GRP78和FOXM1在ER陽性乳腺癌患者中的表達(dá)情況 n（%）

圖3 FOXM1和GRP78的表達(dá)與ER陽性BC患者術(shù)后RFS生存率的關(guān)系

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，我國每年新增乳腺癌27.27萬例，其中ER陽性乳腺癌占所有乳腺癌的75%～80%[7]。ER陽性型乳腺癌治療手段多種多樣，除手術(shù)外還包括內(nèi)分泌治療、細(xì)胞毒性治療、放療以及靶向治療。盡管如此，長期服用內(nèi)分泌藥物導(dǎo)致的各種不良反應(yīng)使得多數(shù)患者無法耐受，部分患者停止服藥后發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，何時(shí)停止服用內(nèi)分泌藥物成為乳腺癌防止復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，甚至有些患者在術(shù)后內(nèi)分泌治療期間出現(xiàn)耐藥甚至發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。尋找特異性分子標(biāo)志物對(duì)提高ER陽性乳腺癌治療效果十分迫切。

表2 單因素和多因素回歸分析影響ER陽性乳腺癌患者RFS的相關(guān)因子

FOXM1是叉頭框（fork head box，F(xiàn)OX）家族成員之一，是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子。FOXM1蛋白由3個(gè)功能區(qū)組成，包括一個(gè)N-末端自動(dòng)控制域（N-terminal autorepressor domain，NRD），一個(gè)保守的DNA結(jié)合域（conserved fork head DNA binding domain，DBD）和C-末端的一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域。FOXM1在增殖的細(xì)胞中高表達(dá)，但在靜止和分化成熟的細(xì)胞中幾乎無法檢測(cè)到。FOXM1是典型的增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期和G2期，維持有絲分裂紡錘體完整性[1]，還參與細(xì)胞周期循環(huán)和組織再生。有研究證明FOXM1在癌癥發(fā)生中起著重要的作用，包括直接參與腫瘤血管生成、增殖、遷移、浸潤、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、轉(zhuǎn)移、早期細(xì)胞衰老的預(yù)防與化療藥物耐藥的產(chǎn)生[1]。

GRP78作為一種分子伴侶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，參與UPR信號(hào)的激活，從而發(fā)生未折疊蛋白應(yīng)答（UPR），激活UPR的三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：IRE-1通路、ATF6通路和PERK通路而發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)GRP78能促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞凋亡。GRP78與激活的凋亡上游因子caspase-7結(jié)合，阻止caspase-7的分解和抑制細(xì)胞的凋亡，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞生長的目的[8]。研究認(rèn)為，GRP78抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡過程，從而影響乳腺癌患者化療效果和預(yù)后[9]。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增加和EMT與乳腺癌化療耐藥相關(guān)[3，10]，GRP78在ER陽性乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)[2]，可能與ECM的積聚和EMT有關(guān)[11-12]。

有研究顯示在乳腺癌中，HER-2調(diào)節(jié)FOXM1的表達(dá)[13]。鄭州大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在腸癌細(xì)胞株SW1116和LOVO中FOXM1與GRP78表達(dá)呈顯著正相關(guān)，F(xiàn)OXM1對(duì)大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用可因GRP78的缺失而明顯減弱，且FOXM1促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞表面GRP78表達(dá)[14]。我們猜想HER-2可能是FOXM1-GRP78信號(hào)通路的上游因子，控制FOXM1和GRP78的表達(dá)，具體機(jī)制待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1和GRP78在ER陽性乳腺癌癌組織中高表達(dá)，癌旁組織中低表達(dá)，二者表達(dá)呈正相關(guān)性；GRP78表達(dá)與脈管侵犯、Ki67有關(guān)，F(xiàn)OXM1表達(dá)與G期、脈管侵犯、Ki67、HER-2有關(guān)；GRP78和FOXM1高表達(dá)均是影響ER陽性乳腺癌患者RFS的因素。提示FOXM1-GRP78信號(hào)通路有可能作為新的乳腺癌分子靶點(diǎn)，用于設(shè)計(jì)新的治療方案來控制腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。