鐵對(duì)帕金森病相關(guān)蛋白LRRK2激活的影響

蘇 晗，張學(xué)武

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林133002）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是和衰老有關(guān)的第二最常見的神經(jīng)退行性疾病，病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失[1]。隨著人口老齡化，PD患病人數(shù)逐年增加。PD發(fā)病原因非常復(fù)雜，目前已知與環(huán)境因素和遺傳因素有關(guān)，尚無有效的治愈方法。研究發(fā)現(xiàn)，PD患者腦黑質(zhì)鐵異常積聚，黑質(zhì)中鐵的含量與PD病情的嚴(yán)重程度正相關(guān)[2-3]。對(duì)400多例PD患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，鐵攝入增多與PD發(fā)病危險(xiǎn)性增加呈正相關(guān)，食用富含鐵食物人群患PD的危險(xiǎn)性增加1.7倍[4]。PD患者黑質(zhì)鐵異常沉積可能與攝入過多外源性鐵以及遺傳因素相關(guān)，異常增多的鐵對(duì)PD相關(guān)基因的功能是否有影響呢？

富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2（leucine-rich repeat kinase2，LRRK2）與PD的發(fā)生密切相關(guān)，LRRK2基因突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性PD[5]。LRRK2基因編碼一個(gè)由2 527個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白激酶，該酶屬于ROCO蛋白激酶家族，包括多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中ROC具有GTP酶活性，MAPKKK是LRRK2的激酶活性區(qū)域，參與調(diào)節(jié)真核翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白 1（4E-BP1）和蛋白激酶 B（AKT）等底物蛋白的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化[6]。至今已有8個(gè)LRRK2基因錯(cuò)義突變被證實(shí)可引起PD的發(fā)生，其中G2019S為最常見的突變類型，見于4%～5%家族性PD和1%散發(fā)性PD，G2019S突變可增強(qiáng)LRRK2自身的激酶活性，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性[7]。LRRK2相關(guān)PD與散發(fā)PD的臨床癥狀相似，很難區(qū)分[8]。而且，最近研究發(fā)現(xiàn)即使LRRK2基因沒有突變，PD患者腦中由LRRK2基因編碼的酶活性比健康人高很多，野生型過量的LRRK2也可導(dǎo)致PD的發(fā)生，表明不管是家族性PD還是散發(fā)性PD，LRRK2均參與致病過程[9]。本研究將與PD發(fā)生密切相關(guān)的兩個(gè)因素鐵和LRRK2結(jié)合起來，觀察在PD發(fā)生過程中鐵對(duì)LRRK2的功能是否有影響，為進(jìn)一步闡明PD的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SHSY5Y）接種于10 cm培養(yǎng)皿、24孔或96孔培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM（Life Technologies）培養(yǎng)，在細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。SH-SY5Y細(xì)胞分別用檸檬酸鐵銨（ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC，終濃度為 5 μg/mL）、6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA，終濃度為 100 μM）以及兩者共同處理SH-SY5Y細(xì)胞，檢測(cè)LRRK2磷酸化（p-LRRK2）及其底物 AKT磷酸化（p-AKT）水平，觀察LRRK2在胞內(nèi)聚集和細(xì)胞ROS水平。

1.2 Western blotting 實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE不連續(xù)電泳系統(tǒng)進(jìn)行垂直板電泳，濃縮膠（5%）電壓為80 V，分離膠（8%）電壓為120 V，直至溴酚蘭抵達(dá)分離膠底部后20 min，斷開電源。采用全濕法（BIORAD電泳儀）穩(wěn)流350 mA將分離膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBS包被2 h，浸入加有一抗（鼠抗p-LRRK2或LRRK2單克隆抗體1∶1 000稀釋，兔抗p-AKT或AKT多克隆抗體1∶1 000 稀釋，Cell Signaling Technology）的新鮮配制的封閉液中，4℃過夜。次日，用抗鼠或抗兔的HRPIgG二抗室溫孵育2 h（1∶5 000稀釋）。將Pierce ECL Western Blotting Substrate（Thermo Fisher Scientific）中試劑A和B各吸出0.5 mL，混勻后將膜浸入其中，于壓片盒中X光片曝光。

1.3 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將帶有Flag標(biāo)記的野生型 LRRK2（WT-LRRK2），G2019S 突變型（G2019SLRRK2） 和 D2017A 突變型（D2017A-LRRK2）的LRRK2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。將這些細(xì)胞接種于放有玻片的24孔培養(yǎng)板中，使細(xì)胞在玻片上貼壁生長(zhǎng)，2天后在培養(yǎng)基中加入FAC（終濃度為5 μg/mL）作用24 h。用 PBS洗3遍，每孔加入300 μL 4%多聚甲醛固定20 min。將玻片取出放置濕盒，滴加含3%羊血清和0.3%Triton X-100的PBS溶液室溫封閉1 h，滴加用1%BSA稀釋的一抗（鼠抗Flag單克隆抗體1∶1 000）后4℃過夜。然后避光加入羊抗鼠熒光二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h。共聚焦顯微鏡（Leica）觀察LRRK2在胞內(nèi)的分布和聚集。

1.4 DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞 ROS水平DCFHDA是檢測(cè)細(xì)胞活性氧常用的熒光探針。DCFH-DA本身無熒光，可以透過細(xì)胞膜被胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。DCFH可被活性氧氧化成有熒光的DCF，根據(jù)DCF的熒光強(qiáng)度判斷胞內(nèi)活性氧的水平。SH-SY5Y細(xì)胞用 5 μmol/L DCFH-DA在 37℃孵育 30 min，PBS洗3次，每次5 min。在Synergy 2酶標(biāo)儀（Bio-Tek）上用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間差異性比較采用單因素F檢驗(yàn)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 檸檬酸鐵銨可促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞LRRK2激活因?yàn)長(zhǎng)RRK2激活首先需要自身磷酸化，繼而發(fā)揮激酶活性催化下游底物磷酸化，因此觀察LRRK2及其底物AKT磷酸化水平，從而推測(cè)LRRK2激酶活性。分別用FAC（5 μg/mL）處理SH-SY5Y細(xì)胞2 h或24 h，用 6-OHDA（100 μmol/L）處理 SH-SY5Y 細(xì)胞 24 h建立PD細(xì)胞模型，以及用FAC和6-OHDA共同處理SH-SY5Y細(xì)胞2 h或24 h。Western blotting結(jié)果顯示：FAC與6-OHDA處理24 h都能使p-LRRK2和p-AKT水平增加，F(xiàn)AC與6-OHDA共同處理后p-LRRK2和p-AKT水平升高得更加明顯。提示鐵可誘導(dǎo)LRRK2磷酸化并使其激活，如果與6-OHDA共同作用則LRRK2的激活程度呈現(xiàn)疊加效應(yīng)。

2.2 檸檬酸鐵銨可促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞LRRK2的聚集 為了觀察鐵對(duì)LRRK2在胞內(nèi)分布和聚集的影響，我們使用帶有Flag標(biāo)記的WT以及G2019S和D2017A突變型LRRK2高表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞株，用 FAC（5 μg/mL）處理 24 h，采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)LRRK2分布。已有報(bào)道G2019S突變可使LRRK2激酶升高，而D2017A則可使LRRK2激酶失活[10]。從圖2可以看出：在PBS處理的三種細(xì)胞中LRRK2（紅色）在胞內(nèi)分布比較均勻；但是經(jīng)過FAC處理后，WT-LRRK2和G2019S-LRRK2出現(xiàn)明顯的聚集，尤其是G2019S突變的LRRK2聚集更顯著，但是在D2017A-LRRK2組沒有明顯的變化。提示FAC可誘導(dǎo)野生型和G2019S突變型的LRRK2在胞內(nèi)聚集，但對(duì)失活型的D2017A-LRRK2沒有影響，即鐵對(duì)LRRK2聚集的誘導(dǎo)與LRRK2激酶的活性相關(guān)。

2.3 檸檬酸鐵銨可使SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平增加 氧化應(yīng)激可能是多巴胺能神經(jīng)元退行性損傷的共同通路，在此我們觀察FAC和6-OHDA對(duì)多巴胺能細(xì)胞ROS水平的影響。從圖3可以看出：FAC和6-OHDA處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，胞內(nèi)ROS水平明顯升高；FAC與6-OHDA共同作用24 h后ROS水平升高更顯著。提示6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型可引起SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷，鐵與6-OHDA一樣，也可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞ROS水平增加，鐵如果與6-OHDA共同作用則ROS量呈現(xiàn)疊加效應(yīng)。

圖2 FAC對(duì)LRRK2在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)積聚的影響

圖3 FAC和6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響

3 討 論

本研究在多巴胺能細(xì)胞上觀察鐵對(duì)PD相關(guān)蛋白LRRK2功能的影響，發(fā)現(xiàn)鐵和6-OHDA可誘導(dǎo)LRRK2磷酸化，增強(qiáng)其激酶活性，使LRRK2發(fā)生積聚，并使胞內(nèi)ROS水平增高。這些結(jié)果提示鐵在PD的發(fā)生過程中可通過增強(qiáng)LRRK2活性對(duì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，PD患者腦黑質(zhì)部位有鐵的沉積，對(duì)PD患者的黑質(zhì)新鮮標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PD患者黑質(zhì)神經(jīng)元鐵的含量異常增加，而且鐵的含量與殘余的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目沒有關(guān)系，說明鐵的異常沉積不是多巴胺能神經(jīng)元凋亡后的繼發(fā)性改變，而很有可能是PD的原發(fā)性病因[2-3，11]。6-OHDA是多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的羥基化類似物，可被多巴胺神經(jīng)元末梢通過軸突逆轉(zhuǎn)運(yùn)至黑質(zhì)內(nèi)的胞體內(nèi)，造成黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷，是常用的PD模型化學(xué)誘導(dǎo)劑[12]。我們成功構(gòu)建了6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞PD模型作為陽性對(duì)照，與FAC同時(shí)使用，發(fā)現(xiàn)FAC不但能誘導(dǎo)正常SH-SY5Y細(xì)胞中LRRK2激活、ROS升高，而且還可使6-OHDA處理的SH-SY5Y細(xì)胞中LRRK2激活更明顯、ROS升高更顯著。

LRRK2是家族性和散發(fā)性PD最常見的致病相關(guān)基因，它由幾個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成，包括ROC、COR和MAPKKK等。在人和鼠的腦、腎、肝等組織中均有LRRK2表達(dá)，但是腦中LRRK2激酶活性明顯高于其他組織，而且更容易發(fā)生自身磷酸化，LRRK2第935位Ser磷酸化可以提高其自身活性[13]。我們的結(jié)果顯示：FAC和6-OHDA不但可以誘導(dǎo)LRRK2的935位Ser磷酸化，還使其底物AKT的磷酸化水平增加，證明FAC和6-OHDA可激活多巴胺能細(xì)胞內(nèi)的LRRK2，提高其激酶活性。非常有意義的是，LRRK2激活的結(jié)果與胞內(nèi)ROS的升高相一致。LRRK2最常見的有意義的突變位點(diǎn)是G2019S，其位于LRRK2激酶結(jié)構(gòu)域，Ser殘基的引入高度模仿了LRRK2激活時(shí)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致LRRK2一直處于活化的狀態(tài)，高活性的LRRK2在胞內(nèi)以積聚的形式存在，使底物蛋白持續(xù)磷酸化，進(jìn)而激活其下游多條信號(hào)途徑，引發(fā)細(xì)胞損傷[10，13]。本研究結(jié)果顯示，鐵可誘導(dǎo)高表達(dá)的野生型和G2019S突變型LRRK2發(fā)生聚集，尤其是G2019S-LRRK2聚集更明顯，而LRRK2激酶失活時(shí)（D2017A-LRRK2）則不能引發(fā)聚集，進(jìn)一步證明鐵可增強(qiáng)LRRK2的活性和功能，從而引起細(xì)胞的氧化損傷。

總之，本研究首次將微量元素鐵與PD相關(guān)蛋白LRRK2結(jié)合起來，也即從環(huán)境因素與遺傳因素角度，證明外源過多攝入的鐵可提高LRRK2激酶的活性，加劇多巴胺能神經(jīng)元的損傷，為尋找有效的PD藥物靶標(biāo)提供了新的理論依據(jù)，推測(cè)發(fā)展穩(wěn)定的鐵離子螯合劑或者LRRK2激酶抑制劑有望成為治療PD的新手段。