不同組方艾康片對細菌性和急性血清病腎炎的療效研究

徐玉輝，高英杰，時宇靜，孫靜，毛鑫，王彥禮，曲天歌，崔曉蘭

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700

艾康臨床經(jīng)驗方原方由川芎、茯苓、甘草、靈芝、金銀花、野菊花、苦參等13味藥組成。艾康去苦參方由不含苦參的其它12味藥組成，以避免苦參中含有的苦參堿、槐定堿、金雀花堿等毒性成分。目前缺乏艾康臨床經(jīng)驗方用于治療腎炎的研究，尤其是缺乏組方中的苦參在治療腎炎時的功效研究[1～2]。已知腎炎的病因有很多，但是主要以細菌性腎炎和免疫性腎炎為主[3～4]。本研究分別以大腸桿菌(E.coli)導(dǎo)致的細菌性腎炎大鼠模型和日本大耳白兔急性血清病腎炎模型為研究對象，以比較含苦參和去苦參組方在腎炎模型中的藥效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性健康SD大鼠，70只，體質(zhì)量(220±10)g，購自北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。隨機分為假手術(shù)組、模型組、阿莫西林組、原方大劑量組、原方小劑量組、缺苦參大劑量組、缺苦參小劑量組，每組10只。

日本大耳白兔(普通級)，42只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄各半，購自北京金牧陽實驗動物公司，動物許可證號：SCXK(京)2015-0005。隨機分為正常組、模型組、雷公藤片組、原方大劑量組、原方小劑量組、缺苦參大劑量組、缺苦參小劑量組，每組6只。

1.2 實驗藥物及給藥 艾康片(批號：20170223-5)和艾康缺苦參樣品(批號：20170217)由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥制劑研究中心生產(chǎn)。生藥量都為：1 g/mL。原方樣品使用的大、小劑量分別為大鼠1.4 g/(kg·d)和0.7 g/(kg·d)，日本大耳白兔0.8 g/(kg·d)和 0.4 g/(kg·d)，相當于人 0.25 g/(kg·d)和 0.13 g/(kg·d)。缺苦參樣品使用的大、小劑量分別為：大鼠1.2 g/(kg·d)和0.6 g/(kg·d)，日本大耳白兔 0.72 g/(kg·d)和 0.36 g/(kg·d)，相當于人 0.23 g/(kg·d)和 0.12 g/(kg·d)。阿莫西林(感染模型的陽性藥)為哈藥集團制藥總廠產(chǎn)品，產(chǎn)品批號：A1611005，規(guī)格0.5 g。人的使用劑量為0.03 g/(kg·d)；大鼠的使用劑量為0.18 g/(kg·d)。雷公藤多苷片(免疫模型的陽性藥)為上海復(fù)旦復(fù)華有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品批號：150502，規(guī)格10 mg。人的使用劑量為0.02 g/(kg·d)；日本大耳白兔的使用劑量為4 mg/(kg·d)。

1.3 實驗菌株 大腸桿菌(E.coli，菌株編號：1.0090)購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所藥理研究室進行傳代，-80℃冰箱保存。

1.4 實驗試劑 營養(yǎng)肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，用于配制細菌培養(yǎng)液；麥康凱瓊脂購自中國藥品生物制品檢定所，用于培養(yǎng)并計數(shù)膀胱穿刺液中的E.coli；用于制備大耳白兔的急性血清病免疫性腎炎模型的牛血清白蛋白(BSA)購自VETEC公司；兔循環(huán)系統(tǒng)免疫復(fù)合物(Circulating immune complexes，CIC)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；動力法測定血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)試劑盒和酶法測定血肌酐(Creatinine，Cr)試劑盒購自北京萬泰德瑞診斷技術(shù)有限公司，全自動生化分析儀(TBA-40FR)購自日本東芝集團。

1.5 大腸桿菌感染的腎炎模型制備及指標檢測方法 參考文獻[5～7]，大鼠禁食水24 h后，每只大鼠腹腔注射10 mL/kg 3.5%水合氯醛麻醉。麻醉后動物仰臥固定手術(shù)臺上，腹部皮膚消毒，下腹正中切開長約2 cm，逐層切開腹壁進入腹腔，暴露膀胱，用動脈夾夾閉陰莖，之后結(jié)扎陰莖。除假手術(shù)組同等條件下膀胱注射生理鹽水外，其余各組用1 mL注射器向膀胱內(nèi)緩慢注入0.75 mL濃度為1×108個/mL的E.coli菌液。然后清理腹腔，逐層縫合腹壁切口，2 h后拆去陰莖結(jié)扎線，6 h后恢復(fù)飲水和供食。手術(shù)后24 h，各給藥組開始給藥，10 mL/(kg·d)，連續(xù)給藥5天，假手術(shù)組和模型組同等條件下灌胃蒸餾水。

給藥5天后，無菌條件下抽取膀胱穿刺液0.1 mL，并把穿刺液接種于麥康凱培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄有無E.coli菌落生長，有生長記為陽性，并計算菌落數(shù)。

1.6 急性血清病腎炎模型的制備及CIC、Cr和BUN的測定參考文獻[8～9]，將BSA用無菌生理鹽水溶解，除正常組，其余各組以250 mg/kg(2 mL/kg)的劑量1次經(jīng)家兔耳緣靜脈注射。正常組，同等條件下，耳緣靜脈注射生理鹽水。完成造模后，分籠飼養(yǎng)。造模后的第2天灌胃給藥，給藥量5 mL/(kg·d)，正常組和模型組同等條件下灌胃蒸餾水。

造模后第10天從耳緣靜脈處取清晨空腹家兔血3 mL，靜置2 h，3 000 r/min，離心20 min，分離血清，于-70℃冰箱中保存。ELISA試劑盒檢測CIC含量。全自動生化分析儀測定血Cr和BUN含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。膀胱穿刺液的細菌培養(yǎng)結(jié)陽性率的組間比較采用χ2檢驗。CIC、Cr和BUN的測定結(jié)果的組間比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)用(±s)表示。2組間數(shù)據(jù)用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膀胱穿刺液細菌陽性率及菌落平均數(shù)量結(jié)果比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的膀胱穿刺液細菌陽性率及菌落平均數(shù)量均上升(P＜0.01)；與模型組比較，阿莫西林組、原方小劑量組和缺苦參小劑量組大鼠的膀胱穿刺液細菌陽性率及菌落平均數(shù)量下降(P＜0.05)；與阿莫西林組比較，缺苦參大劑量組大鼠的膀胱穿刺液細菌陽性率及菌落平均數(shù)量均升高(P＜0.01)。

表1 各組大鼠膀胱穿刺液細菌陽性率及菌落平均數(shù)量結(jié)果比較

2.2 各組日本大耳白兔CIC、Cr、BUN檢測結(jié)果比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組日本大耳白兔CIC顯著升高(P＜0.01)，BUN、Cr沒有差異；與模型組比較，雷公藤片組日本大耳白兔、原方大劑量組、原方小劑量組、缺苦參大劑量組、缺苦參小劑量組CIC顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，BUN、Cr沒有差異；與雷公藤片組比較，各組日本大耳白兔血清CIC、BUN、Cr均沒有差異。

表2 各組日本大耳白兔CIC、Cr、BUN檢測結(jié)果比較

3 討論

腎炎存在多種病因，以感染性和急性免疫性為主。而艾康組方在這2種不同病因的腎炎中起作用的方式可能存在差別[4，10]。有關(guān)中藥在腎炎中的組方研究已經(jīng)有較多的報道[9，11～12]。但是有關(guān)艾康組方在腎炎方面的研究則較少。本研究在大鼠和日本大耳白兔中成功地制備了上述2種腎炎模型，然后給予不同組方和劑量大小的艾康片，以觀察其對腎炎初步的干預(yù)效果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)艾康片對由E.coli感染引起的腎炎動物模型效果較為明顯，對急性血清病腎炎動物模型血清中的CIC水平有明顯的降低作用。

在研究艾康片對由E.coli感染引起的腎炎有效性時，本研究首先觀察了培養(yǎng)的定性結(jié)果，即是否有E.coli在培養(yǎng)基上生長。在此基礎(chǔ)上，我們又分析了陽性培養(yǎng)結(jié)果中的E.coli菌落數(shù)在不同處理組之間的差別，結(jié)果進一步說明小劑量組膀胱穿刺液中細菌數(shù)較少，大劑量組中的缺苦參大劑量組最多，由此初步證明小劑量組的療效更好。與復(fù)方蛇舌草沖劑和血尿安膠囊試驗中小劑量效果更好的研究結(jié)果基本一致[13～14]。

在采用艾康組方治療由BSA引起的急性血清病免疫性腎炎時，與模型組比較，CIC在血清中的含量在各用藥組中都有明顯降低。由于血清CIC能夠介導(dǎo)產(chǎn)生毛細血管內(nèi)增生性腎小球腎炎，其降低對于治療腎小球腎炎及預(yù)后意義重大[15]。BUN和Cr的變化不大可能原因是模型組和正常對照組之間差異不明顯造成的，也不能排除本研究存在模型不夠和給藥時間短等原因，為進一步明確艾康組方對免疫性腎炎的有效性，在今后的實驗研究中應(yīng)增加動物模型以及延長給藥時間。

本研究成功構(gòu)建了E.coli感染引起的細菌性腎炎大鼠模型和BSA引起的急性血清病腎炎日本大耳白兔模型，在此基礎(chǔ)上通過進一步驗證2種不同艾康組方及其劑量大小對腎炎的有效性，證明艾康組方對感染性腎炎效果較為明顯，對急性血清病腎炎的有效性在血清CIC水平得到體現(xiàn)。

綜合2個試驗，2種組方都有效，但原方更優(yōu)。方中苦參大苦大寒，其退熱泄降，蕩滌濕火之效，能殺濕熱所生之毒，較之黃芩、黃連力量益烈，具有抗病原微生物、利尿等作用[16]。野菊花、金銀花、薄荷疏風(fēng)清熱，以清肺衛(wèi)之熱毒；茯苓、蒼術(shù)健脾祛濕，以祛脾胃之濕滯。共奏清熱燥濕解毒之效。濕熱一去，則陽亦衰微矣。故大隊苦寒之中，少佐丁香、肉桂補火助陽以為反佐，防濕去陽微而功虧一簣，且少火亦可生氣，可保人之元陽不熄。黃芪、靈芝益氣扶正，固本培元。溫陽與益氣共用，可防止諸藥苦寒太過，傷人脾胃。川芎、木香活血行氣，通達氣血，使氣行血暢，壅滯之濕熱毒邪自可隨氣血而去。甘草甘平緩急，調(diào)和諸藥?？鄥⒌幕钚猿煞謴?fù)雜，苦參中苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、金雀花堿等毒性有確切報道[17]，臨床也有苦參應(yīng)用中毒的報道[18～19]，但是去除苦參后，療效有所降低，因此可對缺苦參方繼續(xù)進行研究，找到更有效的用藥劑量和藥物配伍。