糖腎康方對(duì)db/db小鼠糖脂代謝及腎臟組織病理的影響

張東鵬，張定華，史曉偉，劉怡，裴文麗

甘肅省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730050

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的難治性慢性并發(fā)癥之一。在發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，DN已成為終末期腎臟疾病的第一位病因(約占35%)和因患糖尿病死亡的主要原因，在我國(guó)DN患者也逐年增長(zhǎng)[1～3]。DN屬中醫(yī)學(xué)水腫、尿濁、脹滿、關(guān)格、腎消等范疇。DN是由于糖尿病(消渴病)遷延不愈，耗傷腎氣，濕濁瘀阻所致。其主要病位在腎，但與肝、心、脾、肺多臟腑密切相關(guān)[4～6]。張定華等[7]認(rèn)為“腎氣虧虛、濕濁瘀阻”為DN的主要病機(jī)特點(diǎn)，提出“補(bǔ)腎益氣、通絡(luò)化濁”法，確立治療DN的中藥組方糖腎康方(TSK)，其前期研究發(fā)現(xiàn)TSK含藥血清能夠抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中Cx43 mRNA表達(dá)下降，DAG mRNA、IP3 mRNA和PKC mRNA呈高表達(dá)，TSK治療后Cx43 mRNA表達(dá)升高，DAG mRNA、IP3 mRNA和PKC mRNA表達(dá)均下降。

db/db小鼠是因位于小鼠4號(hào)染色體上的瘦素受體基因突變導(dǎo)致瘦素缺乏的先天肥胖性2型糖尿病小鼠。db/db小鼠8周齡時(shí)出現(xiàn)明顯高血糖，12～14周齡出現(xiàn)腎小球肥大、系膜細(xì)胞增寬、腎小球基底膜增厚，是目前國(guó)際公認(rèn)的糖尿病腎病動(dòng)物模型。本研究將觀察TSK對(duì)db/db小鼠的血脂、血糖、24 h尿蛋白及腎組織病理的影響，探討TSK對(duì)其腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制，為TSK的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 杜仲、黃芪各30 g(甘肅康樂藥業(yè)有限公司)，芡實(shí)、澤瀉(蘭州方正醫(yī)藥有限公司)、金櫻子(甘肅雍合堂藥業(yè)有限公司)各20 g，大黃(甘肅雍合堂藥業(yè)有限公司)、水蛭(甘肅康樂藥業(yè)有限公司)各10 g，桃仁(蘭州方正醫(yī)藥有限公司)15 g，所有飲片均購(gòu)自甘肅省中醫(yī)院門診草藥房(鑒定人：李繼文；質(zhì)控狀態(tài)：標(biāo)準(zhǔn))。將以上藥物按原方比例常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)，制成TSK，按成人與小鼠體表面積折算的等效劑量(等效系數(shù)：6.25)為中劑量[8]，該組方已申請(qǐng)國(guó)家專利，專利證號(hào)：ZL201210311984.6。藥物經(jīng)過常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)至含生藥材2.21 g/mL，每組小鼠按10 mL/kg灌胃，70 kg成人每天服用生藥155 g，按體質(zhì)量換算后小鼠等效灌胃量為22.14g/(kg·d)，灌藥濃度即2.21 g/mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。羅格列酮鈉片(規(guī)格：4 mg×15片/盒，由太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司提供，批號(hào)：15090049)。

TSK低、中、高劑量組給藥量為成人劑量的5倍、10倍、20倍，每組小鼠按10 mL/kg灌胃，實(shí)驗(yàn)中TSK低、中、高劑量組具體灌胃劑量分別為11.07、22.14、44.28 g/(kg·d)，模型組灌服相同體積0.9%的生理鹽水，每天1次，連續(xù)12周，空白組不做其他處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡SPF級(jí)雄性db/db小鼠100只，由南京大學(xué)動(dòng)物模式研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016－1124。隨機(jī)分為空白組、模型組、TSK高、中、低劑量組，每組20只，共5組。

1.3 觀察小鼠一般狀況，檢測(cè)體質(zhì)量和隨機(jī)血糖 灌胃12周后，股動(dòng)脈采血，分離血清，-20℃保存。取各組db/db小鼠腎臟組織，置于4%多聚甲醛中固定，液氮儲(chǔ)存，備檢。

1.4 各組小鼠腎臟病理組織變化及各檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定 免疫熒光多重標(biāo)記后，在電子顯微鏡下觀察小鼠腎臟病理切片。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖、甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。各組分別用代謝籠收集24 h尿液，并記錄尿量，離心尿液后取上清液，-20℃儲(chǔ)存，采用雙縮脲法測(cè)定大鼠24 h尿蛋白定量。腎組織切片，過碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)染色法染色，每張切片從腎皮質(zhì)外側(cè)向內(nèi)，自上而下隨機(jī)取2個(gè)(×40)視野，在電子顯微鏡下觀察小鼠腎臟病理切片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況 空白組小鼠精神狀況良好，毛色光澤，活動(dòng)自如，反應(yīng)靈敏，攝食、飲水正常；其余各組小鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，嗜臥、懶動(dòng)。隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，空白組小鼠一般狀態(tài)未見明顯變化；模型組小鼠精神萎靡，毛色晦暗無(wú)光澤，懶動(dòng)；TSK低、中、高劑量組上述癥狀較模型組均有不同程度的改善，以TSK高劑量組改善最為顯著。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果比較 見表1。治療前，與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著增加(P＜0.05)；與模型組比較，TSK低、中、高劑量無(wú)顯著差異。治療后，與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著增加(P＜0.05)；與模型組比較，TSK中、高劑量組體質(zhì)量減小(P＜0.05)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果比較 g

2.3 各組小鼠血糖檢測(cè)結(jié)果比較 見表2。與空白組比較，模型組小鼠血糖顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，TSK高劑量組血糖顯著下降(P＜0.05)。

表2 各組小鼠血糖檢測(cè)結(jié)果比較 mmol/L

2.4 各組小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C檢測(cè)結(jié)果比較 見表3。與空白組比較，模型組小鼠TC、TG、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，TSK中、高劑量組TC、TG、LDL-C顯著降低，HDL-C顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C檢測(cè)結(jié)果比較 mmol/L

2.5 各組小鼠24 h尿白蛋白檢測(cè)結(jié)果比較 見表4。與空白組比較，模型組小鼠24 h尿白蛋白顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，TSK高劑量組第2、4、6、8周和中劑量組第6、8周及低劑量第8周24 h尿白蛋白顯著降低(P＜0.05)。

表4 各組小鼠24 h尿白蛋白檢測(cè)結(jié)果比較 mmol/L

2.6 各組小鼠腎臟病理改變結(jié)果 見圖1。PAS染色，空白組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，系膜區(qū)、基底膜未見明顯異常，TSK低劑量和中劑量組小鼠腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增生、基底膜增厚明顯，部分小球出現(xiàn)分葉，TSK高劑量組小鼠系膜基質(zhì)增生及基底膜增厚顯著改善，系膜基質(zhì)百分比顯著降低。

圖1 各組小鼠腎臟病理改變結(jié)果（×400）

3 討論

腎小球硬化是DN晚期的主要病理表現(xiàn)，活化后的腎小球系膜細(xì)胞異常增生，釋放多種炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6等，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，腎小球逐步硬化，而細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解異常加劇了這一過程的發(fā)生[9～10]。同時(shí)，脂代謝紊亂在糖尿病病程的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了很重要的作用[11]。因此，DN患者不僅血糖異常，脂代謝也紊亂。在治療過程中，降糖的同時(shí)要保證血脂在比較理想的范圍內(nèi)，以延緩并發(fā)癥的發(fā)生。

張定華等[13]結(jié)合前人的理論和自己的多年臨床及實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為“腎氣虧虛，濕濁瘀阻”為DN基本病機(jī)，針對(duì)這一病機(jī)，以“補(bǔ)腎益氣、通絡(luò)化濁”為治法，篩選組方，不斷優(yōu)化，確定了TSK的組方。方中杜仲補(bǔ)中，益精氣，堅(jiān)筋骨，補(bǔ)益先天之腎精，黃芪補(bǔ)益中土，溫養(yǎng)脾胃，補(bǔ)益后天之氣，與杜仲相配，達(dá)到先后天同補(bǔ)，固攝精氣、消除尿中蛋白之效；水蛭、大黃、桃仁相伍，取桃仁承氣之意，化瘀通絡(luò)，治療下焦瘀熱互結(jié)；金櫻子與芡實(shí)相配，取水陸二仙丹之意，進(jìn)一步固腎澀精、縮尿止遺，加強(qiáng)固攝之效，協(xié)助減少尿中蛋白；另加一味澤瀉，利水，滲濕，泄熱，通調(diào)水道，下輸膀胱，使補(bǔ)而不滯。全方先后天同治、氣精同補(bǔ)、補(bǔ)消相配，起到補(bǔ)腎益氣、通絡(luò)化濁之效，達(dá)到消除蛋白、降糖、調(diào)脂之臨床療效。方中采用蟲類藥也是一大特點(diǎn)，蟲類入絡(luò)搜剔，有攻沖之性，善入細(xì)微孔隙。水蛭“主逐惡血、瘀血、月閉、破血瘕積聚、利水道”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究提示水蛭中含有水蛭素等多種活性多肽，具有調(diào)血脂、抗血栓等作用[12]，近年來較多文獻(xiàn)報(bào)道單獨(dú)應(yīng)用水蛭可以降低尿蛋白，減輕腎臟病變[7]。本實(shí)驗(yàn)中，TSK中、高劑量組，明顯可以減少24 h尿白蛋白，調(diào)節(jié)血脂，協(xié)助降血糖，明顯減輕腎小球系膜基質(zhì)增生及基底膜增厚。其原理與影響血脂、血糖代謝有關(guān)，同時(shí)可能通過促進(jìn)過度增殖細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)對(duì)DN的治療作用[13]。