不同養(yǎng)料條件下香菇甲醛脫氫酶活性與甲醛含量的變化研究

辛燕花，張鐵丹，張建華，王菲，連廣平

(1.忻州師范學(xué)院生物系，山西 忻州 034000；2.廣州萬物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 )

香菇(Lentinulaedodes)是一種著名的藥食同源的食用菌，它不僅是我國(guó)的一種特產(chǎn)還是世界第二大食用菌。它被稱為民間的“山珍之王”且有“菇中皇后”之美譽(yù)。然而，一個(gè)不容忽視的問題是香菇是食用菌中含甲醛的典型代表，香菇中的甲醛主要是香菇在生長(zhǎng)發(fā)育過程中逐步形成的，是香菇特有的正常生理代謝產(chǎn)物[1]。近年來，大量的研究者對(duì)香菇中內(nèi)源性甲醛的形成機(jī)制進(jìn)行了研究，并且取得了一定的研究進(jìn)展[2～5]。然而，針對(duì)香菇中甲醛的降解機(jī)制的研究報(bào)道較少。為了防止甲醛造成生物體的致死以及突變，生物體建立了多種修復(fù)機(jī)制，使之能在含甲醛的環(huán)境中更好地生存，其中谷胱甘肽(GSH)依賴型的甲醛氧化途徑就是微生物中廣泛存在的一條解毒途徑[6]。作用于這條途徑的關(guān)鍵酶為甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)ADH)，是脫氫酶家族中的一員，存在于大多數(shù)原核及所有的真核生物中，對(duì)生物體內(nèi)甲醛解毒具有重要作用[7]。目前針對(duì)香菇甲醛脫氫酶的研究比較有限，有研究者對(duì)香菇中的甲醛脫氫酶進(jìn)行了克隆(GenBank GAW01839.1)，同源序列比較發(fā)現(xiàn)與熒光小菇中甲醛脫氫酶有91%的相似性，針對(duì)香菇甲醛脫氫酶對(duì)香菇中甲醛的含量的影響研究還未見任何報(bào)道。

本研究以香農(nóng)8號(hào)作為試驗(yàn)菌株，通過研究不同的栽培條件下香菇不同生長(zhǎng)階段甲醛脫氫酶酶活和甲醛含量的變化，并進(jìn)一步通過在香菇液體培養(yǎng)基中添加甲醛脫氫酶來探討該酶對(duì)香菇甲醛含量的影響，為研究甲醛降解酶的生物學(xué)功能提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇菌種：香農(nóng)8號(hào)菌種，購(gòu)于福建食用菌研究所。

主要試劑：甲醛標(biāo)準(zhǔn)品，上海生工試劑公司；其他試劑均為分析純。

培養(yǎng)基：香菇袋栽培養(yǎng)基：培養(yǎng)料一：木屑50%、麥麩10%、豆餅粉2%、糖0.5%、含水量65%；培養(yǎng)料二：甘蔗渣50%、米糠12.5%、石膏1.5%、尿素0.3%、磷酸二氫鉀0.3%；培養(yǎng)料三：玉米芯50%、木屑20%、麥麩18%、石膏1.5%、含水量65%。PDB液體培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，用紗布過濾，冷卻后加入葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，加蒸餾水定容至1 L。121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2 儀器設(shè)備

B-CJ-2FCS型超凈臺(tái)：佳寶凈化工程設(shè)備有限公司(蘇州)；SHA-CA型恒溫?fù)u床：遠(yuǎn)華機(jī)械設(shè)備有限公司(河北)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：鄄城創(chuàng)新儀器有限公司(山東)；TG16 WS型低速離心機(jī)：湘智離心機(jī)儀器有限公司(長(zhǎng)沙)；WYC-52T型電熱鼓風(fēng)干燥箱：?jiǎn)磮D科學(xué)儀器有限公司(上海)；YXQ-LS-100 A型立式壓力蒸汽滅菌器：禾普生物科技有限公司(西安)；UV-5100型紫外可見分光光度計(jì)：元析儀器有限公司(上海)；KQ5200DV數(shù)控超聲波清洗器：江東精密儀器有限公司(蘇州)。

1.3 香菇不同生長(zhǎng)階段甲醛含量與甲醛脫氫酶的關(guān)系

1.3.1 香菇栽培

將上述3種香菇袋栽培養(yǎng)基按配方稱料拌勻。分別裝入 17 cm× 40 cm×0.05 cm 規(guī)格聚丙烯袋中，121 ℃滅菌60 min，冷卻后接種香菇菌種，每個(gè)處理各重復(fù)3次，菌絲發(fā)滿菌棒后以塑料大棚式栽培，按常規(guī)出菇管理模式管理。

取樣方法：菌絲取樣(菌絲發(fā)滿半袋、發(fā)滿全袋、轉(zhuǎn)色期采樣)，每次隨機(jī)采樣進(jìn)行3次重復(fù)。菌柄和菌蓋取樣：各潮次子實(shí)體取樣品進(jìn)行甲醛檢測(cè)。

1.3.2 甲醛脫氫酶酶活的測(cè)定

香菇甲醛脫氫酶的酶活測(cè)定參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.3.3 甲醛的測(cè)定

對(duì)香菇不同生長(zhǎng)階段的甲醛含量進(jìn)行測(cè)定，甲醛的測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。以甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.015 4x-0.000 7，R2=0.999 4。

1.4 不同來源的甲醛脫氫酶對(duì)香菇菌絲體甲醛含量的影響

1.4.1 甲醛脫氫酶的誘導(dǎo)

在PDA液體培養(yǎng)基中接種等量的香菇菌種后，分別加入甲醛，使甲醛的終濃度依次為：0、0.006‰、0.012‰、0.060‰、0.12‰，以不添加甲醛為對(duì)照，在恒溫?fù)u床中28 ℃，100 r·min-1培養(yǎng)8天，收集菌絲體，并測(cè)定甲醛脫氫酶的酶活，選取最佳的甲醛誘導(dǎo)體系。

1.4.2 甲醛脫氫酶的分離純化

對(duì)經(jīng)過甲醛誘導(dǎo)的香菇菌絲體以及配方一栽培下的新鮮香菇子實(shí)體中的甲醛脫氫酶進(jìn)行初分離純化，參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8]。

粗酶液制備:取適量的香菇液體培養(yǎng)基，過濾得到菌絲球，于研缽加入菌絲球、石英砂、0.02 mol·L-1pH為8.0 的Tris-HCl 緩沖液(比例為1∶1∶2)，冰浴研磨 5 min后，置于高速離心機(jī)中4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，即為 FADH 的粗酶液。稱取新鮮的香菇子實(shí)體0.1 g，按照上述方法制備粗酶液。

硫酸銨沉淀: 取上述粗酶液，加入硫酸銨至終濃度為 30%，攪拌 30 min后置于高速離心機(jī)中4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，并加入硫酸銨至終濃度為 80%，攪拌 30 min后置于高速離心機(jī)中4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min。沉淀溶于0.02 mol·L-1、pH 8.0的Tris-HCl 緩沖液，即得復(fù)溶液。

透析: 將上述復(fù)溶液裝入透析袋中(體積占2/3)，用0.02 mol·L-1、 pH 8.0的Tris-HCl透析 2 h，回收透析袋中的復(fù)溶液，即為 FADH 的初酶液，并將其保存于4 ℃冰箱待用(經(jīng)甲醛誘導(dǎo)后所得的FADH初酶液記為FADH1，經(jīng)香菇子實(shí)體所得的初酶液記為FADH2)。

1.4.3 菌絲體的培養(yǎng)

在香菇液體培養(yǎng)基中接種等量的香菇菌種后，加入經(jīng)甲醛誘導(dǎo)后香菇發(fā)酵所產(chǎn)的甲醛脫氫酶FADH1和香菇自身子實(shí)體分離得到的FADH2，在恒溫?fù)u床中28 ℃，100 r·min-1培養(yǎng)8 d，收集菌絲體，測(cè)定香菇菌絲體中的甲醛含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇不同生長(zhǎng)階段甲醛的含量變化

對(duì)不同栽培料培養(yǎng)下的香菇各個(gè)生長(zhǎng)階段及不同部位的甲醛含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，不同的培養(yǎng)料栽培的香菇在不同的生長(zhǎng)階段及不同的部位甲醛的含量有明顯的差異。其中，培養(yǎng)料一和培養(yǎng)料二栽培下的香菇在菌絲體生長(zhǎng)階段甲醛的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于子實(shí)體生長(zhǎng)階段，并且在形成子實(shí)體后，香菇菌蓋中甲醛的含量要明顯低于菌柄中的甲醛含量，說明在這兩種培養(yǎng)料下香菇中甲醛含量的隨著香菇的生長(zhǎng)發(fā)育成熟，甲醛的含量逐漸的降低。而培養(yǎng)料三栽培的香菇在菌絲體生長(zhǎng)的階段甲醛的含量明顯低于子實(shí)體生長(zhǎng)階段，比較形成子實(shí)體后香菇菌柄和菌蓋中甲醛的含量發(fā)現(xiàn)，菌蓋中甲醛的含量明顯高于菌柄中甲醛的含量，說明在培養(yǎng)料三栽培下的香菇隨著香菇的生長(zhǎng)發(fā)育成熟，甲醛的含量逐漸升高。

圖1 不同培養(yǎng)料栽培下的香菇甲醛含量Fig.1 The effect of different cultivation medium on the content of formaldehyde in Letinous Edodes

2.2 香菇不同生長(zhǎng)階段甲醛脫氫酶的酶活變化

對(duì)不同培養(yǎng)料栽培的香菇各個(gè)生長(zhǎng)階段的甲醛脫氫酶酶活進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，不同培養(yǎng)料栽培的香菇在不同的生長(zhǎng)階段甲醛脫氫酶的酶活不同。其中，培養(yǎng)料一和二栽培的香菇在菌絲體生長(zhǎng)階段檢測(cè)到甲醛脫氫酶的酶活明顯低于子實(shí)體生長(zhǎng)階段，并且發(fā)現(xiàn)香菇在子實(shí)體生長(zhǎng)階段菌柄中的甲醛脫氫酶的酶活明顯低于菌蓋，說明隨著香菇的生長(zhǎng)發(fā)育，香菇中甲醛脫氫酶的酶活一直在上升，這一結(jié)果正好與上述香菇(培養(yǎng)料一、二)中甲醛含量隨著香菇的生長(zhǎng)發(fā)育不斷降低相吻合。培養(yǎng)料三栽培的香菇在菌絲體生長(zhǎng)階段檢測(cè)到甲醛脫氫酶的酶活明顯高于子實(shí)體生長(zhǎng)階段，并且發(fā)現(xiàn)香菇在子實(shí)體生長(zhǎng)階段菌柄中的甲醛脫氫酶的酶活明顯高于菌蓋，說明隨著香菇的生長(zhǎng)發(fā)育，香菇中甲醛脫氫酶的酶活一直在降低，這一結(jié)果同樣與上述香菇(培養(yǎng)料三)中甲醛含量隨著香菇的生長(zhǎng)發(fā)育不斷升高相吻合。綜合上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)香菇中甲醛的含量與甲醛脫氫酶的酶活有一定的關(guān)系。

圖2 不同培養(yǎng)料栽培下香菇FADH的酶活Fig.2 The effect of different cultivation medium on the formaldehyde dehydrogenase activity of Letinous Edodes

2.3 不同來源的甲醛脫氫酶對(duì)香菇菌絲體中甲醛含量的影響

2.3.1 添加經(jīng)甲醛誘導(dǎo)后的甲醛脫氫酶對(duì)香菇菌絲體中甲醛含量的影響

通過測(cè)定在香菇液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的甲醛誘導(dǎo)香菇產(chǎn)甲醛脫氫酶的酶活發(fā)現(xiàn)，不同濃度的甲醛含量對(duì)香菇菌絲體產(chǎn)甲醛脫氫酶有一定的影響(圖3)。從圖3中可以看出，與對(duì)照相比，在香菇菌絲體中添加一定量的甲醛可以誘導(dǎo)香菇菌絲體產(chǎn)甲醛脫氫酶，并且在添加外源甲醛的濃度為0.006‰時(shí)，香菇菌絲體中產(chǎn)甲醛脫氫酶的酶活達(dá)到最大值0.68 U·g-1。

圖3 不同濃度的甲醛對(duì)香菇甲醛脫氫酶的影響Fig.3 The effect of different concentration of formaldehyde on the formaldehyde dehydrogenase activity of Letinous Edodes

對(duì)添加甲醛濃度為0.006‰的香菇液體培養(yǎng)基中的甲醛脫氫酶進(jìn)行分離純化后得到甲醛脫氫酶的初酶液。在香菇液體培養(yǎng)基中添加不同體積的初酶液(0.5、1.0、1.5、2.0 mL)，以不添加初酶液的香菇液體培養(yǎng)基為對(duì)照，進(jìn)行培養(yǎng)后，測(cè)定香菇菌絲體中甲醛的含量，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，香菇菌絲體中甲醛的含量隨著添加甲醛脫氫酶的濃度增加明顯下降，說明甲醛脫氫酶可以有效的降低香菇中甲醛的含量。

圖4 不同濃度的甲醛脫氫酶1對(duì)香菇中甲醛含量的影響Fig.4 The effect of different concentration of formaldehyde dehydrogenase 1 on formaldehyde of Letinous Edodes.

2.3.2 添加香菇子實(shí)體中甲醛脫氫酶對(duì)香菇菌絲體中甲醛含量的影響

將提取新鮮香菇子實(shí)體中的甲醛脫氫酶的初酶液按照不同的濃度添加到香菇的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后，測(cè)定香菇菌絲體中甲醛的含量，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，與對(duì)照相比，香菇菌絲體中甲醛的含量隨著添加甲醛脫氫酶的濃度增加明顯下降，甲醛脫氫酶顯著的降低了香菇菌絲體中甲醛的含量。

圖5 不同濃度的甲醛脫氫酶2對(duì)香菇中甲醛含量的影響Fig.5 The effect of different concentration of formaldehyde dehydrogenase 2 on formaldehyde of Letinous Edodes.

3 討論

香菇中甲醛的形成規(guī)律受環(huán)境因素的影響較明顯，在本研究中，采用了三種不同的培養(yǎng)料栽培香菇，其中培養(yǎng)料一和培養(yǎng)料二栽培下的香菇中甲醛的含量隨著香菇的生長(zhǎng)發(fā)育成熟逐漸下降；培養(yǎng)料三栽培下的香菇中甲醛的含量隨著香菇的生長(zhǎng)發(fā)育成熟逐漸遞增，多數(shù)研究結(jié)果表明香菇在菌絲培養(yǎng)階段甲醛的含量較低(1.46～29.9 mg·kg-1)，隨著原基形成至子實(shí)體成熟，菇體中甲醛含量呈遞增(6.51～20.45 mg·kg-1)[2～4,10]，而本研究中所采用的培養(yǎng)料一栽培下的香菇在子實(shí)體階段甲醛含量明顯低于菌絲體階段，更合適用來栽培香菇。

甲醛脫氫酶作為甲醛氧化途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，對(duì)生物體中的甲醛解毒起著關(guān)鍵的作用。在本研究中，不同培養(yǎng)料栽培的香菇在不同的生長(zhǎng)階段甲醛含量不同，甲醛脫氫酶的酶活性也呈現(xiàn)出一定的變化。比較在同一培養(yǎng)料栽培下，甲醛脫氫酶的酶活越高高，甲醛含量越低；在不同培養(yǎng)料栽培下的香菇，同樣表現(xiàn)出甲醛脫氫酶的酶活越高，甲醛含量越低的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步驗(yàn)證甲醛脫氫酶對(duì)香菇中甲醛的氧化作用，通過在香菇液體培養(yǎng)基中添加甲醛脫氫酶來檢測(cè)香菇中甲醛的含量。

本研究中的香農(nóng)8號(hào)在PDB液體的基礎(chǔ)上，添加了以甲醛作為碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，對(duì)產(chǎn)生的甲醛脫氫酶的酶活進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度甲醛的培養(yǎng)基中香菇菌絲體產(chǎn)FADH的酶活要顯著高于對(duì)照，說明香菇在外源甲醛的誘導(dǎo)下，體內(nèi)甲醛氧化途徑中的甲醛脫氫酶能夠進(jìn)行高效表達(dá)，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，代謝香菇體內(nèi)的甲醛。因此，通過優(yōu)化香菇發(fā)酵條件，提高香菇產(chǎn)甲醛脫氫酶的酶活，來降低香菇體內(nèi)的甲醛是行之有效的方法。其次，對(duì)添加了經(jīng)甲醛誘導(dǎo)后產(chǎn)生的FADH及香菇子實(shí)體自身的FADH后，發(fā)現(xiàn)這兩種來源的酶都能可以有效的降低香菇體內(nèi)的甲醛。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步對(duì)這兩種來源的酶進(jìn)行分離純化，得到純品，探討二者結(jié)構(gòu)的相似與差異，研究其酶學(xué)性質(zhì)，為探討香菇中甲醛含量提供一定的理論依據(jù)。