CTGF、VEGF在卵巢癌組織中的表達(dá)水平及其對(duì)卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響

李秀偉,薛新建,王麗欣

石家莊市欒城人民醫(yī)院婦科,石家莊0514300

卵巢癌是一種比較常見的婦科腫瘤,其病死率 居?jì)D科腫瘤首位[1].卵巢癌的臨床表現(xiàn)多樣,且發(fā)病的隱匿性較高,當(dāng)患者出現(xiàn)特征性癥狀而就診時(shí),卵巢癌已經(jīng)發(fā)展至晚期.因此,早期篩查、及時(shí)診斷對(duì)改善卵巢癌患者的預(yù)后具有十分重要的意義.目前,卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,而且臨床尚缺乏有效的卵巢癌篩查方法[2-3].結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)具有參與介導(dǎo)機(jī)體組織的創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥因子調(diào)節(jié)、血管和組織纖維化生成等作用.近年來,CTGF在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用逐漸得到關(guān)注[4-5].血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是Leung等[6]在1989年發(fā)現(xiàn)的一類促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì),VEGF家族共包括6個(gè)部分,主要促進(jìn)血管和淋巴管的生成.相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),VEGF參與腫瘤細(xì)胞的增殖和腹腔積液的形成等過程,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,但是目前其作用機(jī)制尚不能確切闡述[7].本研究通過檢測(cè)CTGF和VEGF在卵巢癌組織中的表達(dá)水平,探究其對(duì)卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響,現(xiàn)報(bào)道如下.

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年3月至2017年8月石家莊市欒城人民醫(yī)院收治的行手術(shù)治療的卵巢癌患者的病歷資料,并收集對(duì)應(yīng)的手術(shù)切除的卵巢癌組織石蠟標(biāo)本.納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理診斷確診為卵巢癌;②無(wú)內(nèi)科和外科疾病史;③術(shù)前未進(jìn)行化療.排除標(biāo)準(zhǔn):①病歷資料不完整;②卵巢癌轉(zhuǎn)移;③合并妊娠或其他婦科疾病;④合并重要器官功能嚴(yán)重不全.根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn),本研究共納入卵巢癌患者42例,年齡為24～76歲,平均年齡為(41.39±6.74)歲;病理類型:漿液性卵巢癌24例,黏液性卵巢癌8例,子宮內(nèi)膜樣腺癌6例,透明細(xì)胞癌4例.

1.2 檢測(cè)方法

采用免疫組化鏈酶菌抗生素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)法對(duì)卵巢癌原發(fā)灶進(jìn)行檢測(cè),將卵巢癌石蠟標(biāo)本切片,厚度為4 μm,60℃下烤干,常規(guī)脫蠟至水,使用3%H2O2,37℃孵育30 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,微波爐抗原熱修復(fù).病理標(biāo)本按檢測(cè)項(xiàng)目分為CTGF組和VEGF組.CTGF組滴加兔抗人CTGF多克隆抗體(稀釋度為1∶40),VEGF組滴加兔抗人VEGF多克隆抗體(稀釋度為1∶50),4℃孵育過夜,磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次5 min;滴加二抗工作液,37℃孵育30 min,磷酸鹽緩沖液沖洗3次,每次5 min;二氨基聯(lián)苯胺顯色2～10 min,鏡下觀察顯色情況,蒸餾水終止顯色,蘇木精復(fù)染,蒸餾水沖洗,將100%、95%、80%乙醇梯度脫水,二甲苯脫水、透明和封片后,置于顯微鏡下觀察.

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察卵巢癌患者卵巢癌組織中CTGF和VEGF的表達(dá)情況及微血管密度(microvessel density,MVD)、淋巴管密度(lymphatic vessel density,LVD).根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:無(wú)著色評(píng)為0分,淺黃色評(píng)為1分,棕黃色評(píng)為2分,棕褐色評(píng)為3分.根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分:陽(yáng)性細(xì)胞所占比例<25%,評(píng)為0分;陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為25%～50%,評(píng)為1分;陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為51%～75%,評(píng)為2分;陽(yáng)性細(xì)胞所占比例>75%,評(píng)為3分.根據(jù)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分之和對(duì)CTGF和VEGF的表達(dá)情況進(jìn)行判定:0分為陰性表達(dá)(-),1～3分為弱陽(yáng)性表達(dá)(+),4～6分為中等陽(yáng)性表達(dá)(++),>6分為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(+++).MVD和LVD檢測(cè):在100倍光鏡下觀察卵巢癌組織切片,挑選微血管分布最高密度區(qū)域,然后在200倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不重復(fù)視野中被CD34和podoplanin單抗免疫組化染色后的微血管和淋巴管,取其平均值分別作為MVD和LVD.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分-析.符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);使用多元逐步Logistic回歸分析卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素.以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征卵巢癌患者卵巢組織中CTGF、VEGF的表達(dá)情況

不同腹膜轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和分化程度卵巢癌患者卵巢癌組織中CTGF陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.367,P=0.037;χ2=8.575,P=0.003;χ2=9.231,P=0.010);但不同年齡、病理類型、病理分期、臨床分期卵巢癌患者卵巢癌組織中CTGF陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).不同病理分期、臨床分期、腹膜轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度卵巢癌患者卵巢癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(χ2=7.762,P=0.021;χ2=6.675,P=0.010;χ2=4.049,P=0.044;χ2=5.151,P=0.023;χ2=7.779,P=0.020);但不同年齡、病理類型卵巢癌患者卵巢癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).(表1)

2.2 卵巢癌組織中CTGF、VEGF表達(dá)與MVD和LVD的關(guān)系

根據(jù)卵巢癌組織中CTGF和VEGF的表達(dá)情況將患者分為CTGF陽(yáng)性組(n=35)、CTGF陰性組(n=7)、VEGF陽(yáng)性組(n=37)和VEGF陰性組(n=5).CTGF陽(yáng)性組患者的MVD明顯高于CTGF陰性組,VEGF陽(yáng)性組患者的MVD明顯高于VEGF陰性組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.130,P<0.01;t=4.446,P<0.01);CTGF陽(yáng)性組患者的LVD高于CTGF陰性組,VEGF陽(yáng)性組患者的LVD高于VEGF陰性組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.992,P=0.327;t=1.728,P=0.092).(表2)

表1 不同臨床特征卵巢癌患者卵巢癌組織中CTGF、VEGF的表達(dá)情況(n=42)

表2 不同組別卵巢癌患者的MVD、LVD(±s)

表2 不同組別卵巢癌患者的MVD、LVD(±s)

組別CTGF陽(yáng)性組(n=35)CTGF陰性組(n=7)VEGF陽(yáng)性組(n=37)VEGF陰性組(n=5)MVD 37.03±10.34 20.49±4.22 39.62±9.84 19.74±3.01 LVD 10.97±7.06 8.25±3.17 11.88±5.03 7.85±3.45

2.3 卵巢癌患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移影響因素的多因素分析

以是否發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移為因變量,以VEGF、CTGF表達(dá)水平為自變量,行多元逐步Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:VEGF陽(yáng)性表達(dá)是卵巢癌患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),其中VEGF陽(yáng)性表達(dá)患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性是VEGF陰性表達(dá)患者的3.71倍.(表3)

2.4 卵巢癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素的多因素分析

以是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為因變量,以VEGF、CTGF表達(dá)水平為自變量,行多元逐步Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:CTGF陽(yáng)性表達(dá)和VEGF陽(yáng)性表達(dá)均是卵巢癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),其中CTGF陽(yáng)性表達(dá)的卵巢癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性是CTGF陰性表達(dá)患者的1.91倍,VEGF陽(yáng)性表達(dá)患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性是VEGF陰性表達(dá)患者的7.34倍.(表4)

表3 42例卵巢癌患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移影響因素的多因素Logistic回歸分析

表4 42例卵巢癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

卵巢癌的發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤第3位,病死率居于女性生殖系統(tǒng)腫瘤首位[10].由于發(fā)病隱匿、早期無(wú)特異性臨床癥狀及缺乏有效的篩查方法,多數(shù)卵巢癌患者確診時(shí)往往已經(jīng)發(fā)展到臨床晚期,出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.CTGF是多效能生物蛋白分子,能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附、細(xì)胞纖維化及血管生成.相關(guān)研究表明,CTGF參與了腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等病理過程,是腫瘤血管形成的一種重要的促進(jìn)因素,但是CTGF在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制非常復(fù)雜,其在不同組織、不同環(huán)境中發(fā)揮的作用也不相同,甚至?xí)霈F(xiàn)相反的作用[11-12].VEGF是特異的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素,可以與內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖、促進(jìn)血管生成生長(zhǎng)及提高血管的通透性,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用,是導(dǎo)致惡性腹腔積液形成的重要原因[13-14].既往研究表明,VEGF是卵巢癌診斷以及預(yù)后評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖,通過提高血管通透性等作用促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15].卵巢癌在生長(zhǎng)過程中,會(huì)出現(xiàn)大量的新生血管和淋巴管,促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[16].因此,CTGF與VEGF的表達(dá)可能對(duì)卵巢癌的早期檢測(cè)、預(yù)后評(píng)價(jià)及預(yù)估轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)具有一定價(jià)值.

本研究通過對(duì)42例卵巢癌患者進(jìn)行研究,其中發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移29例,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例,共檢出CTGF陽(yáng)性35例,VEGF陽(yáng)性37例.卵巢癌組織中CTGF陽(yáng)性表達(dá)與卵巢癌患者的腹膜轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和分化程度有關(guān),但與卵巢癌患者的年齡、病理類型、病理分期、臨床分期無(wú)關(guān).卵巢癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)與卵巢癌患者的病理分期、臨床分期、腹膜轉(zhuǎn)移情況、淋巴轉(zhuǎn)移情況和分化程度有關(guān),但與卵巢癌患者的年齡、病理類型無(wú)關(guān),本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果基本相符[17].同時(shí),本研究結(jié)果還顯示,CTGF陽(yáng)性組患者的MVD明顯高于CTGF陰性組,VEGF陽(yáng)性組患者的MVD明顯高于VEGF陰性組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);CTGF陽(yáng)性組患者的LVD高于CTGF陰性組,VEGF陽(yáng)性組患者的LVD高于CTGF陰性組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明CTGF與VEGF與卵巢癌組織的血管生成有關(guān),從而影響卵巢癌患者的腹膜轉(zhuǎn)移情況,與張宗瑧等[18]和Moran-Jones等[19]研究結(jié)果基本相符.本研究進(jìn)一步通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),VEGF陽(yáng)性表達(dá)是卵巢癌患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),CTGF陽(yáng)性表達(dá)和VEGF陽(yáng)性表達(dá)均是卵巢癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),CTGF陽(yáng)性表達(dá)的卵巢癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性是CTGF陰性表達(dá)患者的1.91倍,VEGF陽(yáng)性表達(dá)患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性是VEGF陰性表達(dá)患者的3.71倍與7.34倍,說明VEGF具有促進(jìn)卵巢癌發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用,CTGF和VEGF均具有促進(jìn)卵巢癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用,推測(cè)兩者均可以作為預(yù)測(cè)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子.但是在陳秀瑋等[20]研究中,CTGF在正常卵巢組織中表達(dá)水平高于卵巢癌組織,更高的CTGF表達(dá)水平預(yù)示著更長(zhǎng)的生存時(shí)間,在卵巢癌患者中起保護(hù)作用,且CTGF與VEGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與本研究不符,分析導(dǎo)致此種顯現(xiàn)的原因可能與本研究樣本量較小有關(guān).

綜上所述,卵巢癌組織中CTGF和VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率均較高,且與卵巢癌患者的腹膜轉(zhuǎn)移情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度等臨床特征有關(guān),因此推測(cè)CTGF、VEGF能夠促進(jìn)卵巢癌組織微血管和淋巴管的生成,促進(jìn)卵巢癌患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.但仍需要更加深入的研究以明確CTGF、VEGF在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制,為臨床卵巢癌診療做出指導(dǎo).