硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐變過程中酚類物質(zhì)及相關(guān)酶活性的影響

毛沛琪，李厚華，李 嬡，曹志秀，韓美玲，張延龍

(西北農(nóng)林科技大學 風景園林藝術(shù)學院，陜西 楊陵 712100)

牡丹為芍藥科芍藥屬多年生落葉小灌木，是原產(chǎn)中國的傳統(tǒng)名貴木本花卉。‘鳳丹’牡丹(Paeoniaostii‘Feng dan’)為牡丹野生種楊山牡丹的栽培品種，其不但具有很好的觀賞價值與藥用作用，同時還有較高的油用價值，是中國油用牡丹主栽品種，占目前油用牡丹栽培面積的90%以上。研究表明，牡丹籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸、亞麻酸、亞油酸和油酸，具有抗腫瘤、抗炎、改善心血管和調(diào)節(jié)免疫等醫(yī)療保健等功能[1-2]。目前‘鳳丹’牡丹主要有播種、嫁接、分株等傳統(tǒng)繁殖方式，但播種方式存在不易保持親本優(yōu)良性狀，而嫁接和分株的繁殖率低，影響了‘鳳丹’苗木商品化生產(chǎn)和育種工作的進行，組織培養(yǎng)能夠加快繁殖速度并保持親本的優(yōu)良性狀，是解決上述問題的有效途徑[3]。目前許多學者采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行‘鳳丹’牡丹的快繁，外植體涉及離體胚[4]、鱗芽[5-7]等，在試驗過程中均發(fā)現(xiàn)組培材料褐化是‘鳳丹’牡丹快速繁殖的一大障礙，目前防褐劑在褐變過程中的作用機理還不夠明確。

褐變現(xiàn)象是指在建立外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分隔效應被打破，酚類化合物分泌，由于酚類的不穩(wěn)定性，在溢出過程中與外界氧氣發(fā)生氧化反應被迅速氧化變成褐色，外植體也隨之發(fā)生褐變進而死亡的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象又被稱為酚污染[8-9]。組織培養(yǎng)過程中引起褐變的主要原因為酶促褐變，與酶促褐變相關(guān)的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)[10-11]等。另一方面，酚類物質(zhì)作為酶促褐變反應的底物，M.A.Dalal[12]等學者經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其含量與褐變的發(fā)生具有正相關(guān)性，說明酚類是影響褐變水平的主要原因之一。本課題組前期研究中，在對比了硝酸銀與活性炭對外植體褐化的影響后發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入硝酸銀能夠有效降低‘鳳丹’組培苗的褐變率[6]。并確定了以‘鳳丹’牡丹芽為材料最適的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，成活率為64.32%。已有研究表明，硝酸銀作為防褐劑用于刺梨花藥組織培養(yǎng)中在促進愈傷組織的生長的同時也能有效控制褐化[13]，并發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加硝酸銀能夠影響葡萄[14]和胡椒[15]愈傷組織中酚類物質(zhì)的含量。本研究通過分析硝酸銀與愈傷組織中酚類物質(zhì)含量及種類，以及硝酸銀與超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)活性之間的關(guān)系，探究硝酸銀對牡丹組培苗愈傷組織褐變進程的影響，為 ‘鳳丹’牡丹褐化深層次原因分析以及防褐劑的開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

從本課題組的組培實驗室選取生長健壯、無污染無褐化的同期組培苗。

標準樣品:蘆丁、綠原酸、香豆酸、對香豆酸、根皮苷購自天津易方科技有限公司；兒茶素、表兒茶素、槲皮素，購自金測分析技術(shù)有限公司。

1.2 試驗處理

選取生長健壯，無污染無褐化現(xiàn)象出現(xiàn)的‘鳳丹’牡丹組織培養(yǎng)獲得的增殖幼苗接種至含有1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-1硝酸銀的培養(yǎng)基(MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA)中，以不加硝酸銀的培養(yǎng)基為對照(CK)，共6個組合，組合內(nèi)設(shè)置3組重復，每組20個，在常規(guī)條件下[溫度(25±1)℃，光強36 μmol·m-2·s-1，光照時間12 h/d]誘導培養(yǎng)。在將材料轉(zhuǎn)接至含有硝酸銀的培養(yǎng)基后7 d左右切口處將逐漸長出愈傷組織，在轉(zhuǎn)接后10、30、50 d取材統(tǒng)計測量相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 褐變分級 褐變級別根據(jù)愈傷組織褐色顏色深淺劃分為5個等級，用1、2、3、4、5分別表示(圖1)。分別在培養(yǎng)后10、30、50 d后統(tǒng)計每個處理的褐變情況，對每組20個試驗材料的褐變等級進行打分，取加權(quán)平均值作為每組的最終褐化等級。

注：A：褐化1級，無明顯褐化現(xiàn)象；B：褐化2級，出現(xiàn)褐化斑點；C：褐化3級，邊緣明顯褐化；D:褐化4級，褐化蔓延至中部；E:褐化5級，完全褐化。

圖1‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐變程度的5個等級

Fig.1 Five levels of browning ofP.ostii‘Feng dan’ callus

1.3.2 酚類物質(zhì)測定 粗提取液制備：取組培苗下端新長出的愈傷組織進行冷凍干燥；均勻混合后精確稱取粉末0.03 g，用1.5 mL甲醇浸提，超聲提取60 min，浸提結(jié)束后，4 000 rad·min-1離心10 min，收集上清液備用。共6個組合，每個組合包含3個重復組，選取褐變等級處在每組加權(quán)平均值附近的5個外植體。

多酚含量測定：方法參考Yi[16]等方法并略作修改。將沒食子酸用滅菌去離子水溶解成濃度為104 μg·mL-1的標準液，分別將標準液0、0.10、0.30、0.50、0.80 mL與1.00 mL置于10 mL離心管中，然后依次加入1.70 mL 20%的Na2CO3·10H2O溶液以及500 μL稀釋一倍的Folin-Ciocalteu試劑，蒸餾水定容。避光放置1.5 h后，測定吸光值(最大吸光值765 nm處)，標曲為y=0.119 6x(R2=0.997 0)，x的單位是μg·mL-1。吸取100 μL提取液，按標準曲線步驟反應后測吸光度，結(jié)果以每百克干樣所含沒食子酸的的當量毫克數(shù)(mg/100 g DW)表示。

單體酚種類和含量測定：將上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液為待測提取液，進樣量為0.5 mL；利用高效液相色譜儀測定單體酚種類及含量，設(shè)定參數(shù)為Lachrom-C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm，進樣量10 μL，柱溫箱的溫度40℃。流動相有2個：A，0.04%的甲酸水；B，乙腈(色譜級)。梯度洗脫(流速為0.5 mL·min-1)：0～40 min，A 為95%～0，B為5%～100%；40～60 min，B為100%。

1.3.3 酶液提取 精確稱取0.5 g愈傷組織，加入預冷的酶提取液(50 mmol·L-1pH 7.8磷酸緩沖液)， 冰浴下研磨成勻漿，永高速冷凍離心機在4℃、9 000 rad·min-1條件下離心20 min，上清液即為待測酶液，低溫下保存?zhèn)溆?。?個組合，每個組合包含3個重復組，選取褐變等級處在每組加權(quán)平均值附近的5個外植體。

1.3.4 多酚氧化酶PPO活性測定 取0.5 mL 0.01 mol·L-1鄰苯二酚加入2 mL磷酸緩沖液(pH 7.0)中，加入0.5 mL酶提取液，立即于410 nm下測定吸光值，每分鐘計數(shù)，以不加酶提取液的反應液為空白對照。以每分鐘吸光值變化0.01為1個多酚氧化酶活性單位。酶活(U·g-1·min-1)=A470V·(0.01WVtt)-1。A470為反應時間內(nèi)吸光度的變化；V為提取酶液的總量(mL)；W為材料鮮重(g)；Vt為反應體系中加入的酶液量(mL)；t為反應時間。

1.3.5 過氧化物酶( POD)活性測定 POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。POD反應液：于50 mL的燒杯中依次加入50 μL 0.1 mol·L-1pH6.0的磷酸緩沖液，28 μL的愈創(chuàng)木酚，19 μL 30% H2O2混勻待用。測定時，取粗酶提取液1 mL加入7 mL POD反應液中，以pH 7.8磷酸緩沖液調(diào)零，混勻后即刻計時，于470 nm下定吸光度值，計算酶活力。以每分鐘吸光值變化0.01為1個多酚氧化酶活性單位。計算公式同PPO。

1.3.6 超氧化物歧物酶(SOD)活性測定 SOD活性測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法。取50 μL的酶液，依次加入1/15 mol·L-1磷酸緩沖液1.5 mL，130 mmol·L-1甲硫氨酸(Met) 0.3 mL，750 μmol·L-1氮藍四唑(NBT) 0.3 mL，100 μmol·L-1EDTA-Na20.3 mL，20 μmol·L-1核黃素0.3 mL,蒸餾水2.5 mL。同時取一支試管作對照(CK)，一支作空白(以緩沖液代替酶液)，將空白管置于暗處，CK與酶液一同置于4 000 lx條件下光照30 min后立即遮光保存，空白調(diào)零，在560 nm下測定吸光值。酶活(U·g-1·FW·min-1)=(Ack-AE)V/(Ack0.5WVt)。A為光密度值；V為提取酶液的總量(mL)；W為材料鮮重(g)；Vt為反應體系中加入的酶液量(mL)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在探究硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐化控制作用試驗中，根據(jù)培養(yǎng)基中加入的硝酸銀濃度的不同設(shè)不同處理組，共6個組合，每個組合中設(shè)置3組重復，每組20個外植體，獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析及差異性顯著檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硝酸銀對組培苗褐變程度的影響

不同濃度的硝酸銀處理下，通過對褐變程度的分級可以發(fā)現(xiàn)，添加硝酸銀能夠明顯抑制牡丹組培苗的褐變，隨著硝酸銀濃度的增加，褐化抑制效果先有所提高，但超過3 mg·L-1后抑制效果開始明顯下降，綜合各方面表現(xiàn)，當硝酸銀濃度為2 mg·L-1的處理組對褐化的抑制綜合效果最好(表1)。

表1 不同硝酸銀濃度培養(yǎng)下‘鳳丹’牡丹愈傷組織的褐化級別

2.2 總酚含量的變化

紫外分光光度計檢測結(jié)果表：在‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐化過程中，其總酚含量是隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸升高，3個培養(yǎng)階段對照組的總酚含量均高于處理組。培養(yǎng)10 d時不同處理的實驗材料初步表現(xiàn)出一定的差異，隨著培養(yǎng)時間延長差異逐漸變大，50 d時呈現(xiàn)出顯著差異。各個取材階段中隨著AgNO3濃度的增加，總酚含量先減少后升高。其中，AgNO3濃度為2 mg·L-1時總酚含量在3個測試階段均表現(xiàn)為各組最低(圖2)。

圖2 不同濃度硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織總酚含量的影響

2.3 單體酚含量變化

通過對‘鳳丹’牡丹愈傷組織甲醇萃取液在280 nm波長下的高效液相色譜檢測結(jié)果分析，到鑒定出6種單體酚，分別是蘆丁、綠原酸、對香豆酸、香豆酸、二氫槲皮素、表兒茶素。這些單體酚的含量隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸升高，其中蘆丁含量最高且相較其他幾種單體酚增幅也最大，說明蘆丁在‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐化過程中被氧化的最少，其可能并未主導整個褐化過程。

與總酚含量測量結(jié)果一致的是，同一取材時間點對照組的單體酚含量均多于處理組，其中，AgNO3濃度為2 mg·L-1時單體酚含量均表現(xiàn)為各組最低(圖3)。

2.4 多酚氧化酶(PPO)活性

圖表變化趨勢顯示：PPO的活性隨著培養(yǎng)時間的延長而增強，在不同的取材階段PPO活性隨著硝酸銀濃度的增加先減弱后增強。當AgNO3濃度為2 mg·L-1時PPO活性在各處理組中均最低(圖4)。

2.5 過氧化物酶(POD)活性

檢測結(jié)果表明，POD的活性隨著培養(yǎng)時間的延長而降低，隨著硝酸銀濃度的增加先增強后減弱，培養(yǎng)30 d時各處理組的活性差異最明顯。當AgNO3濃度為2 mg·L-1時POD活性始終在同批測量材料中保持最高(圖5)。

2.6 超氧化物歧物酶(SOD)活性

愈傷組織的SOD活性在培養(yǎng)10 d時各處理組之間差別不明顯，但隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸表現(xiàn)出較為明顯的差異，其變化趨勢較為一致。AgNO3濃度為2 mg·L-1和3 mg·L-1時相對于別的處理組表現(xiàn)出較高的活性(圖6)。

2.7 各個生理指標的綜合相關(guān)分析

用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件分析了本次試驗測定的5個生理指標的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明：總多酚與褐變等級呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性(P<0.01)，過氧化物酶活性與褐變程度呈現(xiàn)顯著負相關(guān)(P<0.05)，多酚氧化酶活性與褐變程度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.05)，超氧化物歧物酶與褐變等級無明顯相關(guān)性。

注：a:‘鳳丹’組培苗在添加防褐劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d；b:培養(yǎng)30 d；c:培養(yǎng)50 d。

圖3不同濃度硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織單體酚含量的影響

Fig.3 Effect of different concentrations of silver nitrate on monomeric phenol content ofP.ostii‘Feng dan’ callus

圖4 不同濃度硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織多酚氧化酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

在‘鳳丹’牡丹培養(yǎng)基中添加不同濃度的硝酸銀后，增殖幼苗獲得的組培苗其愈傷組織的褐變均有不同程度降低，證實了硝酸銀作為防褐劑能夠在有效抑制褐變。當加入的硝酸銀濃度為2.0 mg·L-1時組培材料的褐變程度為所有試驗組中最低，且組培苗綜合生長情況最佳。植物組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的褐變主要是由酶促褐變引起的[17]。酶、底物(酚類物質(zhì))和氧氣是酶促褐變發(fā)生的必要條件，細胞損傷后其中的酚類物質(zhì)釋放被氧化成醌，醌類物質(zhì)經(jīng)過一系列反應最后形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變，因此酚類物質(zhì)的含量與外植體褐變緊密相關(guān)[18]。本試驗結(jié)果表明，總多酚在褐變發(fā)生過程中隨著褐變程度呈正相關(guān)。這與許傳俊[11]等在蝴蝶蘭中得出的結(jié)果是一致的，因此推測多酚含量應該是對‘鳳丹’牡丹愈傷組織褐變影響最大的因素。已有學者通過試驗證明，減少酚類合成可以有效減輕褐變[19-20]，而本試驗數(shù)據(jù)顯示在培養(yǎng)基中加入硝酸銀的處理組中的總酚和單體酚含量均低于對照組，說明硝酸銀能夠影響酚類物質(zhì)的合成[14-15]，進而達到控制褐變的效果。試驗中檢測到的綠原酸、二氫槲皮素、香豆酸、對香豆酸、表兒茶素、蘆丁也曾在牡丹葉片中被檢測出[21]，其中蘆丁是檢測到的6種單體酚中隨褐化程度變化最明顯的，說明蘆丁可能相較于其他5種檢測到的單體酚氧化量最少。

圖5 不同濃度硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織過氧化物酶活性的影響

圖6 不同濃度硝酸銀對‘鳳丹’牡丹愈傷組織SOD活性的影響

PPO主要催化酚類及其衍生物的氧化還原反應，在POD共同作用下最終形成褐色的聚合體[22]。試驗結(jié)果顯示PPO活性與褐變等級呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。同樣的現(xiàn)象在菊芋[23]和驅(qū)蚊香草[24]中也有報道。POD活性與褐變程度呈現(xiàn)顯著負相關(guān)，這與李新鳳[25]在其他牡丹品種中的研究報道相一致。另外，這2種酶的活性在不同的取材時期中的活性隨著硝酸銀濃度的變化而呈現(xiàn)出類似的變化趨勢，其中PPO的活性隨著硝酸銀濃度增加呈現(xiàn)先降低后增高的現(xiàn)象與多酚含量的變化相一致，但是POD的活性變化情況卻是先增高后降低，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可以認為是由于POD是植物體內(nèi)參與防御反應的酶，加入硝酸銀能夠增加POD活性[26]，但是Ag+作為大多數(shù)酶的不可逆抑制劑[27]，重金屬脅迫使植物細胞內(nèi)活性氧自由基增多[28]，細胞代謝發(fā)生紊亂，導致酶活下降。試驗結(jié)果表明，PPO和POD這2種酶的活性在一定程度上都能夠影響植物外植體的褐變水平，這與許傳俊[11]等在蝴蝶蘭中的實驗結(jié)果一致。而SOD的活性在本試驗中并未表現(xiàn)出與褐變現(xiàn)象的聯(lián)系。綜上所述，我們可以通過抑制PPO活性或者提升POD活性以達到抑制褐變的目的。從本試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，POD、PPO、SOD的活性隨著硝酸銀濃度的增加也呈現(xiàn)一定的規(guī)律性變化，這可能預示著硝酸銀對酶活存在一定的影響，但其與硝酸銀對影響酚類物質(zhì)合成的機理還有待進一步研究。