白芷藥材及其混偽品的ITS2序列分子鑒定△

吳正軍，魏偉鋒，韓正洲，崔英賢，陳新連，王瑀*

(1.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 本溪 117004；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/國(guó)家中醫(yī)藥管理局 中藥資源保護(hù)重點(diǎn)研究室，北京 100193)

白芷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被列為中品，在我國(guó)擁有悠久的藥食兩用歷史[1]。《中華人民共和藥典》(2015年版)規(guī)定，白芷藥材為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根[2]，其性溫、味辛，入胃、大腸、肺經(jīng)，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效，用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛等癥[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白芷具有解熱、鎮(zhèn)痛、平喘、降壓以及興奮呼吸和運(yùn)動(dòng)中樞等作用，同時(shí)白芷在抗菌、解痙、美白等方面也具有很好的作用[3-7]。因其能“長(zhǎng)肌膚，潤(rùn)澤，可作面脂”，成為我國(guó)古代美容護(hù)膚類(lèi)方劑的寵兒[8-9]。另外，白芷制劑結(jié)合黑光照射在治療白癜風(fēng)和銀屑病等方面也取得了很好的效果[10-11]。近年來(lái)，臨床用藥量的增加以及美容產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成了白芷藥材在市場(chǎng)流通中需求量大幅增加的現(xiàn)象。白芷以根入藥，經(jīng)加工炮制后外形特征丟失，與其他近緣種根類(lèi)藥材極其相似，鑒定困難，市場(chǎng)流通中白芷藥材的混偽、摻假現(xiàn)象十分嚴(yán)重。白芷藥材常見(jiàn)混偽品有糙獨(dú)活HeracleumscabridumFranch.、白亮獨(dú)活H.candicansWall.ex DC.、白云花H.repulaFranch.、下延葉古當(dāng)歸A.decurrensLedeb.、隔山香Ostericumcitriodorum(Hance)Yuan et Shan、短毛獨(dú)活H.moellendorffiiHance等，多種混偽品出現(xiàn)在白芷藥材流通的各個(gè)環(huán)節(jié)，嚴(yán)重影響了白芷藥材臨床用藥的準(zhǔn)確性和安全性，因此急需尋找一種快速、準(zhǔn)確的分子鑒定方法，以確保臨床用藥安全。

DNA條形碼鑒定技術(shù)在中藥材鑒定中具有高效、快速、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，是近年來(lái)動(dòng)植物藥材鑒定的主要方法之一。ITS2序列被選為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼[12]，并已經(jīng)在多個(gè)藥用植物及其混偽品的鑒定中得到驗(yàn)證[13-17]。本研究利用ITS2序列對(duì)白芷、杭白芷及其混偽品進(jìn)行鑒定，旨在建立一種快速、準(zhǔn)確鑒定白芷藥材的方法，以規(guī)范白芷藥材市場(chǎng)，保證臨床用藥安全。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共涉及白芷、杭白芷及其混偽品共計(jì)7個(gè)物種44份樣本，白芷樣品分別來(lái)自重慶、云南、安徽、河南等地，杭白芷樣品分別來(lái)自廣西、四川、重慶等地。實(shí)驗(yàn)樣品均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定。另外，從GenBank上下載部分白芷及其混偽品的ITS2序列。實(shí)驗(yàn)樣品來(lái)源詳見(jiàn)表1。

表1 白芷、杭白芷及其混偽品樣品信息表

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 樣品處理參照陳士林等[18]的研究方法，白芷藥材樣品用75%乙醇擦拭表面后，刮去外表皮，取樣約40 mg，硅膠干燥后的葉片樣品取約20 mg，并加入約樣品量10%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，用DNA提取研磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次·s-1)后，用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。提取過(guò)程完全按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中根類(lèi)樣品在加入細(xì)胞裂解液后56 ℃水浴過(guò)夜，葉片類(lèi)樣本在65 ℃水浴放置30 min。PCR擴(kuò)增體系的配制及擴(kuò)增程序的設(shè)定依照文獻(xiàn)[19]。將PCR產(chǎn)物采用ABI 3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序峰圖利用CodonCode Aligner V 3.7.1(CodonCode Co.，USA)校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)。獲得的所有序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8 S和28 S區(qū)段即可獲得ITS2間隔區(qū)序列[20]。然后，將所有序列用軟件MEGA 6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)分析比對(duì)，并基于K2P模型進(jìn)行種內(nèi)種間變異位點(diǎn)和遺傳距離的分析，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，利用bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。

2 結(jié)果

2.1 白芷藥材ITS2序列特征及種內(nèi)變異

白芷不同來(lái)源的ITS2序列共15條，序列長(zhǎng)度為227 bp，GC含量為54.26%～55.51%，平均GC含量為55.05%。種內(nèi)共存在2個(gè)變異位點(diǎn)，分別是第171位的T-C變異和第208位的G-A變異，共獲得3種單倍型(見(jiàn)表2)，種內(nèi)K2P遺傳距離為0～0.009 2；杭白芷不同來(lái)源的ITS2序列共10條，長(zhǎng)度均為227 bp，GC含量為55.07%，種內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn)，種內(nèi)K2P遺傳距離為0，說(shuō)明杭白芷種內(nèi)ITS2序列高度保守。杭白芷ITS2序列與白芷主導(dǎo)單倍型(H1)序列相同，序列類(lèi)型見(jiàn)圖1。白芷主導(dǎo)單倍型(H1)樣本ITS2序列峰圖特征見(jiàn)圖2。

表2 白芷單倍型類(lèi)型

圖1 白芷(H1)ITS2序列

圖2 白芷ITS2序列測(cè)序峰圖

2.2 白芷藥材及其混偽品ITS2序列種間變異分析

白芷、杭白芷及其混偽品的ITS2序列共44條，利用MEGA 6.0計(jì)算ITS2序列的種間K2P遺傳距離，結(jié)果顯示，白芷與杭白芷的種間K2P遺傳距離是0～0.004 5，白芷與其混偽品的種間K2P遺傳距離為0.052 8～0.321 3，遠(yuǎn)大于白芷種內(nèi)、白芷與杭白芷的種間K2P遺傳距離，所以用ITS2序列能很好地鑒別白芷藥材及其混偽品，具體K2P遺傳距離如表3所示。白芷、杭白芷及其混偽品種間變異位點(diǎn)見(jiàn)圖3。

2.3 白芷藥材及其混偽品的NJ樹(shù)鑒定

基于白芷、杭白芷及其各混偽品的ITS2序列主導(dǎo)單倍型構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，結(jié)果表明白芷和杭白芷聚為一支，支持率為99%，說(shuō)明兩基原植物親緣關(guān)系較近，僅靠ITS2序列無(wú)法進(jìn)行區(qū)分。同時(shí)，白芷、杭白芷與各混偽品均能明顯分開(kāi)，支持率均大于50%(見(jiàn)圖4)。因此，ITS2序列作為DNA條形碼可以很好地將白芷藥材(白芷、杭白芷)及其混偽品區(qū)分開(kāi)。

表3 白芷、杭白芷及其各混偽品的種間K2P遺傳距離

注：.表示與第一行相同堿基。圖3 白芷、杭白芷及其混偽品種間變異位點(diǎn)

圖4 基于ITS2序列構(gòu)建白芷藥材及其混偽品的NJ樹(shù)

3 討論

中藥白芷為根類(lèi)藥材，細(xì)胞中存在多糖和多酚等次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)在DNA提取過(guò)程中易與DNA發(fā)生共沉淀，影響DNA的提取效率。因此，實(shí)驗(yàn)中增加取樣量，同時(shí)根類(lèi)藥材先用75%乙醇將根的表面擦拭干凈，取靠近表皮的內(nèi)部材料，以避免真菌類(lèi)污染。另外，樣品中加入的PVP-40不僅可以與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物，還可以和多糖結(jié)合，有效去除樣品中殘留的多酚和多糖類(lèi)雜質(zhì)，減少DNA污染[21]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中適當(dāng)延長(zhǎng)根類(lèi)藥材的水浴時(shí)間，使細(xì)胞充分裂解釋放DNA，提高提取效率。

DNA條形碼技術(shù)至今已有十多年的發(fā)展歷程，它打破了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)物種鑒定的局限性[22]，為中藥鑒定學(xué)、親緣學(xué)及進(jìn)化學(xué)等領(lǐng)域的研究帶來(lái)了新的發(fā)展機(jī)遇。陳士林等[23]認(rèn)為基于ITS2序列的藥用植物分子鑒定技術(shù)作為中藥鑒定領(lǐng)域的新方法，不僅要保證其具有結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，還要保證其在中藥鑒定領(lǐng)域具有較強(qiáng)的實(shí)用性和通用性。辛天怡等[24]通過(guò)研究證實(shí)了ITS2序列在羌活藥材DNA條形碼鑒定中具有很好的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性。陳新連等[25]研究表明ITS2序列可以鑒別朱砂根及其混偽品。本研究成功獲得白芷ITS2序列共15條，共有2個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)，種內(nèi)平均K2P遺傳距離為0.002 7，白芷與其變種杭白芷的種間K2P遺傳距離為0～0.004 5，表明白芷種內(nèi)ITS2序列變異較小，其作為DNA條形碼鑒定的通用序列具有很好的穩(wěn)定性，且白芷藥材兩基原植物親緣關(guān)系較近。通過(guò)對(duì)白芷藥材及其混偽品進(jìn)行基于ITS2序列的鑒定分析可知，白芷與其混偽品的種間K2P遺傳距離為0.052 8～0.321 3，杭白芷與其混偽品的種間K2P遺傳距離為0.060 8～0.339 5，均遠(yuǎn)大于白芷和杭白芷種內(nèi)、種間的K2P遺傳距離；且在NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，白芷與杭白芷聚為一支，無(wú)法區(qū)分開(kāi)，這兩個(gè)物種的鑒別有待于更進(jìn)一步的研究。其混偽品單獨(dú)聚為一支，與白芷藥材(白芷、杭白芷)明顯區(qū)分開(kāi)。NJ樹(shù)結(jié)果表明，ITS2序列能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)白芷藥材及其混偽品的準(zhǔn)確鑒定，有利于白芷藥材在市場(chǎng)上的流通和管理，確保臨床用藥安全。