周志豪,黃振華,周朝生,陸榮茂,曾國(guó)權(quán),陳星星
(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 溫州 325005)
砷是一種普遍存在于藻類(lèi)中主要的有害重金屬元素之一,其毒性不僅與元素總量有關(guān),還與其存在的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)[1]。As的化學(xué)形態(tài)包括高毒性的As(Ⅲ)、As(Ⅴ),低毒性的甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)和基本無(wú)毒的三甲基砷酸(TMA)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)和砷糖(AsS)。目前,對(duì)砷的形態(tài)分析主要集中在中藥材、香菇,而藻類(lèi)中As的相關(guān)研究主要集中在對(duì)其總量的測(cè)定,對(duì)于其形態(tài)分析研究較少。為對(duì)藻類(lèi)樣品中As的不同形態(tài)進(jìn)行有效的分離測(cè)定,合適的分離手段和檢測(cè)方法必不可少。HPLC具有分離高沸點(diǎn)、難揮發(fā)性的物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn),而且能設(shè)置不同分離程序;電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍寬、干擾少、可連續(xù)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。因此,采用HPLC與ICP-MS聯(lián)用技術(shù)建立同時(shí)快速檢測(cè)藻類(lèi)各形態(tài)As的分析方法,旨在為藻類(lèi)中As的形態(tài)分析及其安全性評(píng)價(jià)提供參考[2-4]。
2016年9月~2016年12月間,在浙江蒼南、洞頭、平陽(yáng)、瑞安、舟山六橫蒼洞、三門(mén)、臨海、溫嶺采集了6個(gè)羊棲菜、9個(gè)海帶、19個(gè)紫菜, 這3個(gè)品種共34個(gè)藻類(lèi)樣品。
AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ(含量分別為(28.0±1.1)、(38.8±1.1)、(75.7±1.2)、(52.9±1.8)、(25.1±0.8)、(17.5±0.4)μg ·g-1)國(guó)家計(jì)量科學(xué)研究院;磷酸二氫銨(優(yōu)級(jí)純);雙氧水(優(yōu)級(jí)純);硝酸(優(yōu)級(jí)純)
采用安捷倫7900電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測(cè)定As;采用安捷倫1260HPLC和7900電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)聯(lián)用測(cè)定砷的形態(tài);ETHOS UP密閉微波消解儀(意大利Milestone公司)。
1.3.1 HPLC-ICP-MS條件
HPLC條件:Hamilton PRPX-100陰離子交換柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流動(dòng)相A:水,流動(dòng)相B:25 mmol/L磷酸二氫銨溶液(以氨水調(diào)節(jié)pH值至8.0);梯度洗脫程序:0~15min,100%A~100%B,15~20min,100%B~100%A;20~25min,100%A;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量50 μL。
1.3.2 樣品前處理
用采樣點(diǎn)海水清洗去除海藻表面附著物。4 ℃下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。超純水沖洗數(shù)次,60 ℃烘干至恒重。磨碎,過(guò)60目篩于-20 ℃,密封避光保存待測(cè)[1,5]。分析過(guò)程以國(guó)家生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10023(紫菜)進(jìn)行質(zhì)量控制。
1.3.3 總砷含量的測(cè)定
準(zhǔn)確稱(chēng)取藻類(lèi)樣品1.000 g(精確到0.0001 g)于微波消解管中,加入6 mL優(yōu)級(jí)純硝酸,2 mL優(yōu)級(jí)純過(guò)氧化氫,采用微波消解儀消化至溶液澄清透明,消解程序見(jiàn)表1。消解程序結(jié)束后,待其冷卻,取出消解管,于160 ℃趕酸至近干,用體積分?jǐn)?shù)2 %硝酸定容至10 mL,過(guò)0.22μm濾膜,同時(shí)做樣品空白,配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,用ICP-MS儀檢測(cè)樣品中總砷的含量。
1.3.4 提取方式的選擇
設(shè)計(jì)了機(jī)械振蕩裝置,并研究了不同的振蕩頻率、振蕩時(shí)間(180~360min)對(duì)6種形態(tài)砷化物的提取。
1.3.5 藻類(lèi)樣品中6種形態(tài)砷化合物的提取
準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0000 g(精確到0.0001 g)藻類(lèi)樣品于50 mL離心管中,加入30 mL 0.3 mol/L乙酸溶液提取,將藻類(lèi)樣品混合均勻后進(jìn)行振蕩提取,10000 r/min離心10min,收集上清液,將沉淀重復(fù)提取2次,合并上清液,將上清液于1 0000 r/min離心10min后過(guò)0.22 μm濾膜,40 ℃條件下濃縮至近干,用超純水定容至10 mL,過(guò)0.22 μm濾膜進(jìn)行HPLC-ICP-MS分析。
樣品中的AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ等砷形態(tài)化合物,會(huì)由于溶液中的不同的pH值而呈現(xiàn)不同的電性,從而影響其在柱子上的保留時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)采用了Hamilton PRPX-100(250 mm×4.1 mm,10 μm)陰離子交換柱對(duì)不同形態(tài)的As進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。選取了碳酸銨溶液、磷酸鹽緩沖液及磷酸二氫銨溶液3種流動(dòng)相進(jìn)行分離。結(jié)果表明,AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ這6種形態(tài)砷在磷酸二氫銨溶液作用下,分離時(shí)間較短,峰形較佳;而在流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液和碳酸銨溶液作用下,6種砷形態(tài)化合物并不能完全分離,AsC和AsB無(wú)法分開(kāi)。另外實(shí)驗(yàn)還考察了磷酸二氫銨濃度對(duì)6種形態(tài)砷保留時(shí)間的影響,分別采用15、20、25、30和35 mmol/L,5種不同濃度的磷酸二氫銨溶液,對(duì)6種形態(tài)As的混標(biāo)溶液進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,當(dāng)磷酸二氫銨濃度增大時(shí),各形態(tài)As的保留時(shí)間表現(xiàn)各不相同,AsⅤ的保留時(shí)間快速的減少,DMA、MMA的保留時(shí)間緩慢的減少,AsC、AsB、AsⅢ的保留時(shí)間并沒(méi)有太大變化,這表明磷酸二氫銨濃度增大時(shí),對(duì)不同形態(tài)的砷洗脫能力并不完全相同;當(dāng)磷酸二氫銨濃度達(dá)到25 mmol/L時(shí),20min內(nèi)6種形態(tài)的As達(dá)到基線分離,峰形較佳,已能完全滿足測(cè)試要求,當(dāng)度大于25 mmol/L時(shí)部分形態(tài)As的色譜峰開(kāi)始出現(xiàn)重疊,而且流動(dòng)相濃度過(guò)大,易在柱子內(nèi)沉積堵塞,因此本實(shí)驗(yàn)采用25 mmol/L磷酸二氫銨為流動(dòng)相[7]。
pH值對(duì)不同形態(tài)As的分離有較大的影響,實(shí)驗(yàn)考察了pH值對(duì)其保留時(shí)間的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):pH值在5.0~10.0范圍時(shí),6種形態(tài)的As可以較好地分離開(kāi),由于pH值增大有利于縮短分離時(shí)間,因此為了保證分離度的同時(shí)縮短分析時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)選擇pH值8.0。
圖1 磷酸二氫銨濃度對(duì)6種形態(tài)As的色譜保留時(shí)間的影響
圖2 磷酸二氫銨pH值對(duì)6種形態(tài)As的色譜峰保留時(shí)間的影響
對(duì)于多形態(tài)砷提取劑相關(guān)報(bào)道,常見(jiàn)的提取溶劑有水、低濃度酸、甲醇水等體系。本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑的萃取效率,在實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)采用甲醇/水(體積比1∶1)振蕩提取時(shí),各形態(tài)As的總提取效率有時(shí)會(huì)高達(dá)130%。這可能是因?yàn)榧状既軇┨岣吡薃s的離子化效率,從而增強(qiáng)了As的信號(hào)值。另外采用甲醇溶劑會(huì)使得實(shí)際樣品的提取液與標(biāo)準(zhǔn)溶液pH值存在差異,也就使得保留時(shí)間產(chǎn)生偏移,但是乙酸作為提取劑可以有效地避免這一現(xiàn)象。
振蕩提取裝置是實(shí)驗(yàn)室自我設(shè)計(jì)的裝置,如圖3所示。
13a1:提取管;13b:提取管配件;13a2提取管密封蓋;12a:第一夾頭;12b:第二夾頭;12c:懸置部圖3 振蕩提取裝置
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試,發(fā)現(xiàn)振蕩頻率在200 r/min;時(shí)間設(shè)置在200min,對(duì)藻類(lèi)中砷的提取較完全。
分別配制1、2、5、10、20、50 μg/L的系列砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的HPLC條件下進(jìn)行分析,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,如表1所示,6種形態(tài)的砷化合物的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9980。在優(yōu)化的HPLC工作條件下,采用逐級(jí)稀釋法以3倍信噪比測(cè)定檢出限,AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的檢出限分別為0.26、0.27、0.0.34、0.29、0.24、0.31 μg/L。
表1 6種砷化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度
為考察方法的精密度,選擇50 μg/L的6種砷形態(tài)的混合標(biāo)樣連續(xù)測(cè)定6次,按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析,以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)價(jià)其重復(fù)性,如表1所示,6種形態(tài)砷化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%~3.9%,均小于5%。
選擇藻類(lèi)樣品進(jìn)行研究,選擇提取效果最好的0.3 mol/L乙酸溶液進(jìn)行振蕩提取,分別向其中加入低、中、高3種濃度的6種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定,如表所示。AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的加標(biāo)回收率分別為92.5%~96.35%、94.2%~98.2%、89.1%~93.1%、85.1%~90.1%、92.1%~98.3%、88.1%~93.4%。
AsC為砷膽堿、AsB為砷甜菜堿、AsⅢ為三價(jià)砷、DMA為二甲基砷、MMA為一甲基砷、AsⅤ為五價(jià)砷
圖4 藻類(lèi)樣品的HPLC-ICP-MS色譜圖
樣品經(jīng)過(guò)0.3 mol·L-1乙酸溶液振蕩提取,如圖1所示,發(fā)現(xiàn)羊棲菜砷的種類(lèi)較多,在砷甜菜堿和五價(jià)砷之間有三個(gè)未知峰;其次是海帶,除了一個(gè)三價(jià)峰以外,也有三個(gè)未知峰;紫菜中砷的種類(lèi)較少,一個(gè)三價(jià)峰和一個(gè)未知峰,從圖中還可以發(fā)現(xiàn)紫菜中有機(jī)砷占總砷比例比羊棲菜和海帶都要大。
本研究發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化色譜條件時(shí),AsC、AsB和 As(Ⅲ)并沒(méi)有隨著我們對(duì)流動(dòng)相濃度改變,出峰時(shí)間而發(fā)生變化,因?yàn)樵谔荻认疵摮绦颍?~20min,100%A~100%B,而最晚出峰的As(Ⅲ)也僅2.6min,因此流動(dòng)相溶液大部分為水溶液,而水溶液中,As(Ⅲ)、As(V)、DMA和MMA是以陰離子形式存在,而AsB和AsC是以陽(yáng)離子形式存在[6]。因此,對(duì)于陰離子交換柱,在以磷酸二氫銨為流動(dòng)相條件下,As(Ⅲ)、As(V)、DMA、MMA和色譜柱固定相上的離子交換劑基團(tuán)相互作用,二甲基砷以HA和A-各占一半的形式存在,因此在陰離子色譜柱上有一定保留;一甲基砷完全以HA-的形式存在,因此在陰離子色譜柱上保留強(qiáng)于二甲基,而As(V)部分已經(jīng)以HA2-的形式存在,是這幾種離子中保留最強(qiáng)的,按照作用力的大小,As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(V)依次被洗脫出來(lái)[8]。而AsC和AsB無(wú)法與離子交換劑的交換中心發(fā)生交換,只能隨著流動(dòng)相先流出,因此當(dāng)As(Ⅲ)、As(V)、DMA、MMA、AsC和AsB同時(shí)存在時(shí),總是AsC和AsB最先出峰[7-9]。
萃取溶劑的選擇。在研究樣品提取溶劑時(shí),剛開(kāi)始考慮甲醇水作為提取溶劑,但我們發(fā)現(xiàn)甲醇水比例較難把握,較少對(duì)樣品提取效率不高,多了甲醇具有弱變形性質(zhì),反而降低了提取效率,這可能是甲醇含量多了,提取出樣品中有機(jī)物質(zhì),從而干擾了測(cè)定的精確性,并且要甲醇的增敏效應(yīng),必然在前處理中增加相應(yīng)的操作步驟,給實(shí)驗(yàn)操作者帶來(lái)一定勞動(dòng)強(qiáng)度。其二,甲醇屬于無(wú)色易揮發(fā)的液體,具有一定的毒性,對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者身體健康有潛在的危害。其三,乙酸在作為提取溶劑時(shí),與標(biāo)準(zhǔn)溶液在pH值上保持了一致,避免了樣品峰的偏移,并且能有效的提取樣品中的多形態(tài)砷[10-11]。
建立了AsC、AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ6種形態(tài)As的HPLC-ICP-MS方法。6種不同形態(tài)的As的HPLC-ICP-MS方法。6種不同形態(tài)的As在20min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離。藻類(lèi)中的As含量較低,且大部分以低毒的砷糖形式存在。振蕩溶劑提取能同時(shí)將有機(jī)As和無(wú)機(jī)As提取出來(lái),較客觀地反映樣品中As的形態(tài)分布。對(duì)于藻類(lèi)樣品中As的安全性評(píng)價(jià)而言,其形態(tài)分析比總量檢測(cè)更為合理。本方法準(zhǔn)確、可靠,可為藻類(lèi)中As的形態(tài)分析及安全性評(píng)價(jià)提供參考。