李培源,彭炳華,莫媛媛,霍麗妮,秦一蘭
(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,廣西 南寧 530001;2.廣西師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,廣西 南寧 530001;3.廣西南寧市第五十六中學(xué),廣西 南寧 530001)
龍眼葉為無(wú)患子科植物龍眼的葉或嫩芽。全年可采。我國(guó)西南部至東南部栽培很廣,以福建、臺(tái)灣最盛,廣東次之,多栽培于堤岸和園圃,廣東、廣西南部及云南亦見(jiàn)野生或半野生于疏林中。功能主治為:治感冒,瘧疾,疔腫,痔瘡。《生草藥性備要》:治疳疔,殺蟲,作茶飲明目,蒸水,加冰片搽眼眩爛?!侗静萸笤罚合答?、痔、疳瘡、爛腳。《泉州本草》:治瘧疾,龍眼葉七葉,芝麻一酒盞。清水二杯,煎一杯,在瘧疾發(fā)作前二小時(shí)內(nèi)服。人體新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量自由基,與動(dòng)脈硬化等多種疾病相關(guān)[1-5]。由于合成的抗氧化劑副作用多,近年來(lái)科研工作者致力于尋找來(lái)源于植物的天然抗氧化劑[6-8]。龍眼葉作為一種常用的草藥,其抗氧化方面的研究較少研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)冷浸法得到龍眼葉丙酮提取物,采用DPPH體系,評(píng)估其對(duì)自由基清除能力。
UV1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析電子科技有限公司);龍眼葉藥材購(gòu)于廣西百色;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于百靈威試劑公司(北京);所有試劑均為分析純。
稱取20 g龍眼葉粉末,加入200 mL丙酮(95%),冷浸72 h。重復(fù)上述操作3次,合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑,得到龍眼葉丙酮提取物。
2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定
精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液(1mg/mL)于10 mL量瓶中,分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL,靜置6min,加入5%硝酸鋁0.4mL,靜置6min。加5%氫氧化鈉試液4.0 mL,用95%丙酮稀釋至刻度,搖勻。靜置15min,在510nm處測(cè)定吸收度。以吸收度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,推出回歸方程。
2.2.2 龍眼葉丙酮提取物總黃酮含量測(cè)定
將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液換為固定濃度提取物溶液,同上操作測(cè)定吸光度,多次測(cè)量求平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的蘆丁當(dāng)量,總黃酮含量以每克干物質(zhì)的蘆丁當(dāng)量(mg)表示,并計(jì)算提取得率。
取不同濃度龍眼葉丙酮提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波長(zhǎng)處(517 nm)測(cè)吸光度,直到平衡為止。清除率計(jì)算公式如下:S % = (1-A樣品)/ A空白× 100%。其中,A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度,A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。
以吸收度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照所得的回歸方程計(jì)算得出龍眼葉丙酮提取物的總黃酮含量。結(jié)果表明,龍眼葉丙酮提取物的總黃酮含量超過(guò)20 mg/g。近年來(lái)科研工作者研究發(fā)現(xiàn)許多黃酮類物質(zhì)表現(xiàn)出抗氧化效果,龍眼葉丙酮提取物具有較高的總黃酮,可能具有較好的抗氧化能力。
3.2.1 不同濃度提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力
龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨提取物溶液濃度升高的變化情況如圖1所示。在較低的藥液濃度下,龍眼葉丙酮提取物表現(xiàn)出了較高的DPPH自由基的清除能力。藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí),龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除率為44.23%。藥液濃度為0.5 mg/mL時(shí),龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除效果增加為藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)數(shù)值的1.3倍;藥液濃度為0.8 mg/mL時(shí),龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基為60.94%,是藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)清除率的1.37倍。在中等藥液濃度下,龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除效果增加。藥液濃度為1.5 mg/mL時(shí)龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除率為為65.12%。在最高藥液濃度(2.0 mg/mL)時(shí)龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除率達(dá)到了67.94%。
圖1 不同濃度龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力
3.2.2 不同時(shí)間提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力
圖2 不同時(shí)間龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力(濃度=1.5 mg/mL)
龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率與時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。對(duì)于藥液濃度為1.5 mg/mL的龍眼葉丙酮提取物,在10min時(shí),龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為62.14%;在20min時(shí),龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為65.25%,是10min時(shí)的1.05倍;在30min時(shí),龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率為65.12%。可見(jiàn),龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率在10~30min的范圍內(nèi)變化不大。
EC50指的是抗氧化劑對(duì)自由基的抑制率為50%時(shí)的藥液濃度。龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的EC50值為0.33 mg/mL,表明在藥液濃度為0.33 mg/mL時(shí),龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到50%。龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基較低的EC50值表明其對(duì)DPPH自由基具有良好的清除能力,這可能與其較高含量的黃酮類物質(zhì)有關(guān)。
本論文通過(guò)冷浸法得到龍眼葉丙酮提取物,以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定該提取物的總黃酮含量,并采用DPPH體系評(píng)價(jià)其對(duì)自由基的清除能力。結(jié)果表明,龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基顯示出良好的清除效果,濃度為2.0 mg/mL時(shí)清除率為67.94%,其對(duì)DPPH自由基的EC50值為0.33 mg/mL。龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基清除能力與藥液濃度有關(guān),藥液濃度越高,眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。同時(shí),龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基清除能力與作用時(shí)間關(guān)系不大,作用時(shí)間為10~30min范圍內(nèi)時(shí)龍眼葉丙酮提取物對(duì)DPPH自由基清除能力基本在同一水平。