DPPH法測定龍眼葉丙酮提取物的自由基清除能力

李培源，彭炳華，莫媛媛，霍麗妮，秦一蘭

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.廣西師范學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，廣西 南寧 530001；3.廣西南寧市第五十六中學(xué)，廣西 南寧 530001)

龍眼葉為無患子科植物龍眼的葉或嫩芽。全年可采。我國西南部至東南部栽培很廣，以福建、臺灣最盛，廣東次之，多栽培于堤岸和園圃，廣東、廣西南部及云南亦見野生或半野生于疏林中。功能主治為：治感冒，瘧疾，疔腫，痔瘡?！渡菟幮詡湟罚褐勿狃郏瑲⑾x，作茶飲明目，蒸水，加冰片搽眼眩爛?！侗静萸笤罚合答邸⒅?、疳瘡、爛腳?！度荼静荨罚褐委懠玻堁廴~七葉，芝麻一酒盞。清水二杯，煎一杯，在瘧疾發(fā)作前二小時(shí)內(nèi)服。人體新陳代謝過程中產(chǎn)生的過量自由基，與動(dòng)脈硬化等多種疾病相關(guān)[1-5]。由于合成的抗氧化劑副作用多，近年來科研工作者致力于尋找來源于植物的天然抗氧化劑[6-8]。龍眼葉作為一種常用的草藥，其抗氧化方面的研究較少研究。本實(shí)驗(yàn)通過冷浸法得到龍眼葉丙酮提取物，采用DPPH體系，評估其對自由基清除能力。

1 材料與儀器

UV1901型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析電子科技有限公司)；龍眼葉藥材購于廣西百色；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于百靈威試劑公司(北京)；所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 龍眼葉丙酮提取物制備

稱取20 g龍眼葉粉末，加入200 mL丙酮(95%)，冷浸72 h。重復(fù)上述操作3次，合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到龍眼葉丙酮提取物。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

精密吸取蘆丁對照品溶液(1mg/mL)于10 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL，靜置6min，加入5%硝酸鋁0.4mL，靜置6min。加5%氫氧化鈉試液4.0 mL，用95%丙酮稀釋至刻度，搖勻。靜置15min，在510nm處測定吸收度。以吸收度對溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推出回歸方程。

2.2.2 龍眼葉丙酮提取物總黃酮含量測定

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液換為固定濃度提取物溶液，同上操作測定吸光度，多次測量求平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的蘆丁當(dāng)量，總黃酮含量以每克干物質(zhì)的蘆丁當(dāng)量(mg)表示，并計(jì)算提取得率。

2.3 二苯基苦味肼基自由基(DPPH)體系[4]

取不同濃度龍眼葉丙酮提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波長處(517 nm)測吸光度，直到平衡為止。清除率計(jì)算公式如下：S % = (1-A樣品)/ A空白× 100%。其中，A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度，A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 龍眼葉丙酮提取物總黃酮含量測定結(jié)果

以吸收度對溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照所得的回歸方程計(jì)算得出龍眼葉丙酮提取物的總黃酮含量。結(jié)果表明，龍眼葉丙酮提取物的總黃酮含量超過20 mg/g。近年來科研工作者研究發(fā)現(xiàn)許多黃酮類物質(zhì)表現(xiàn)出抗氧化效果，龍眼葉丙酮提取物具有較高的總黃酮，可能具有較好的抗氧化能力。

3.2 龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力

3.2.1 不同濃度提取物對DPPH自由基的清除能力

龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力隨提取物溶液濃度升高的變化情況如圖1所示。在較低的藥液濃度下，龍眼葉丙酮提取物表現(xiàn)出了較高的DPPH自由基的清除能力。藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)，龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除率為44.23%。藥液濃度為0.5 mg/mL時(shí)，龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除效果增加為藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)數(shù)值的1.3倍；藥液濃度為0.8 mg/mL時(shí)，龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基為60.94%，是藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)清除率的1.37倍。在中等藥液濃度下，龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除效果增加。藥液濃度為1.5 mg/mL時(shí)龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除率為為65.12%。在最高藥液濃度(2.0 mg/mL)時(shí)龍眼葉丙酮提取物的DPPH自由基清除率達(dá)到了67.94%。

圖1 不同濃度龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力

3.2.2 不同時(shí)間提取物對DPPH自由基的清除能力

圖2 不同時(shí)間龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除能力(濃度=1.5 mg/mL)

龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除率與時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。對于藥液濃度為1.5 mg/mL的龍眼葉丙酮提取物，在10min時(shí)，龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除率為62.14%；在20min時(shí)，龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除率為65.25%，是10min時(shí)的1.05倍；在30min時(shí)，龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除率為65.12%?？梢?，龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除率在10～30min的范圍內(nèi)變化不大。

3.3 龍眼葉丙酮提取物對DPPH的EC50值

EC50指的是抗氧化劑對自由基的抑制率為50%時(shí)的藥液濃度。龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的EC50值為0.33 mg/mL，表明在藥液濃度為0.33 mg/mL時(shí)，龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基的清除率達(dá)到50%。龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基較低的EC50值表明其對DPPH自由基具有良好的清除能力，這可能與其較高含量的黃酮類物質(zhì)有關(guān)。

4 結(jié)論

本論文通過冷浸法得到龍眼葉丙酮提取物，以蘆丁為對照品測定該提取物的總黃酮含量，并采用DPPH體系評價(jià)其對自由基的清除能力。結(jié)果表明，龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基顯示出良好的清除效果，濃度為2.0 mg/mL時(shí)清除率為67.94%，其對DPPH自由基的EC50值為0.33 mg/mL。龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基清除能力與藥液濃度有關(guān)，藥液濃度越高，眼葉丙酮提取物對DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。同時(shí)，龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基清除能力與作用時(shí)間關(guān)系不大，作用時(shí)間為10～30min范圍內(nèi)時(shí)龍眼葉丙酮提取物對DPPH自由基清除能力基本在同一水平。