幽門(mén)螺旋桿菌感染患兒胃黏膜組織中miR-146a表達(dá)及與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)性

孫 波,周 方,李小芹

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化內(nèi)科,鄭州 450000)

幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)作為目前已知的消化性潰瘍、萎縮性胃炎主要致病因素，在胃癌發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[1]。隨著診療手段的進(jìn)步，小兒胃炎、胃潰瘍發(fā)病率不斷升高，且Hp感染陽(yáng)性率較高[2]。研究表明，兒童時(shí)期是Hp感染的高發(fā)階段，且一旦感染可能終身受累[3]。微小RNA(micro RNA，miRNA)作為廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的短小RNA，在與特異性靶位結(jié)合后可通過(guò)影響其轉(zhuǎn)錄而在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。miR-146a是miRNA的重要類(lèi)型，與機(jī)體固有免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、病毒感染等密切相關(guān)[5]；尤其在消化道腫瘤的相關(guān)研究較多，也說(shuō)明了其在消化道疾病中的重要性[6]。Toll樣受體4(toll-like receptor4，TLR4)/細(xì)胞核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)通路是調(diào)控機(jī)體炎性反應(yīng)的重要通路，在促進(jìn)炎性反應(yīng)及多種炎癥因子釋放中發(fā)揮重要作用[7]。有研究指出，機(jī)體免疫炎性反應(yīng)與Hp感染所致疾病密切相關(guān)[8]。故本研究通過(guò)分析Hp感染患兒胃黏膜組織中miR-146a表達(dá)變化，探討其與TKR4/NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)性，以期為Hp感染致病機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年2月至2016年12月在本院就診的患兒107例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)以惡心、嘔吐、反酸、腹痛腹脹、嘔血或黑便為主要癥狀；(2)近2個(gè)月無(wú)抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、離子泵阻滯劑、激素使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者，免疫系統(tǒng)功能障礙者，急慢性感染者，營(yíng)養(yǎng)不良者，內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者，惡性腫瘤者。其中，男61例，女46例，年齡4～14歲，平均年齡(9.32±3.11)歲。所有患兒均接受13C尿素呼氣試驗(yàn)和組織病理Hp染色，根據(jù)二者檢查結(jié)果將患兒分為Hp感染組和非感染組，其中，Hp感染組58例，男35例，女23例，平均年齡(9.36±3.17)歲；非感染組49例，男26例，女23例，平均年齡(9.27±3.05)歲，病因分類(lèi)：飲食因素39例，藥物刺激8例，膽汁反流2例。兩組患兒性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均衡可比。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家長(zhǎng)均知情同意。

1.2主要試劑和設(shè)備 miRCURYTM原位雜交探針購(gòu)自丹麥Exiqon公司，寡核苷酸探針稀釋液購(gòu)自上海魯汶生物科技公司，地高辛標(biāo)記探針購(gòu)自德國(guó)Boerringer公司，生物素化鼠抗地高辛抗體和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，總RNA提取試劑盒(Trizol法)購(gòu)自美國(guó)Mobio公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)公司，miR-146a和U6引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本收集 所有患兒在行胃鏡檢查時(shí)，留取胃竇部胃黏膜組織4塊，2塊用4%甲醛固定石蠟包埋，分別用于檢測(cè)Hp感染和原位雜交試驗(yàn)；另2塊置于液氮保存于-70 ℃冰箱，分別用于PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。

1.3.2原位雜交試驗(yàn)檢測(cè)患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4和NF-κB表達(dá) 取石蠟包埋組織，切片(厚度約2 mm)，脫蠟、水化，PBS沖洗2次，用0.3%枸櫞酸稀釋的蛋白酶消化10 min，PBS沖洗3次，室溫下4%多聚甲醛固定，焦碳酸二乙酯水洗，濕盒中42 ℃預(yù)雜交2 h。取地高辛標(biāo)記探針miR-146a、U6陽(yáng)性對(duì)照和無(wú)義對(duì)照(稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000和1∶1 500)，miR-146a探針序列：AAC CCA TGG AAT TCA GTT CTC A；U6陽(yáng)性對(duì)照探針序列：CAC GAA TTT GCG TGT CAT CCT T；無(wú)義對(duì)照探針序列：GTGTAACACGTCTATACGCCCA。用雜交溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)?0 ℃變性3 min，冰上置2 min，過(guò)夜雜交。用枸櫞酸氯化鈉緩沖液洗滌，37 ℃封閉液封閉60 min，滴加生物素化鼠抗地高辛抗體，室溫下孵育120 min，PBS洗滌3次，滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，室溫下反應(yīng)25 min，PBS洗滌3次，滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，封片觀察。結(jié)果判定：高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，陰性：陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%，陽(yáng)性：陽(yáng)性細(xì)胞比例≥10%。所有切片均由兩位病理科副主任醫(yī)師單獨(dú)完成閱片。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR術(shù)檢測(cè)患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4和NF-κB表達(dá) 取胃黏膜組織，研磨后加入細(xì)胞裂解液，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，用PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 50 s，連續(xù)進(jìn)行38次循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用2-△△Ct法計(jì)算胃黏膜組織中miR-146a相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.4ELISA檢測(cè)患兒胃黏膜組織中炎癥因子水平 取胃黏膜組織，研磨后勻漿，于3 500 r/min離心10 min，取上清液，利用ELISA檢測(cè)黏膜組織中白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平，所有操作均在標(biāo)準(zhǔn)條件下按試劑盒說(shuō)明完成。

2 結(jié) 果

2.1患兒胃黏膜組織中miR-146a表達(dá) 原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-146a主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，被染成黃色或棕黃色顆粒狀。Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a陽(yáng)性表達(dá)率為72.4%(42/58)，非感染組則為22.4%(11/49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.526，P=0.000)，見(jiàn)圖1。

A：miR-146a在Hp感染組中呈高表達(dá)；B：miR-146a在非感染組中呈低表達(dá)

2.2兩組患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4和NF-κB表達(dá) Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4 mRNA和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于非感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3兩組患兒胃黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平 Hp感染組患兒胃黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平均高于非感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 兩組患兒胃黏膜組織中miR-146a、TLR4和NF-κB表達(dá)比較

表3 兩組患兒胃黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平比較

2.4Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a表達(dá)與其他指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a相對(duì)表達(dá)量與TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平均呈正相關(guān)(r=0.307、0.384、0.265、0.271、0.292、0.345，P=0.002、0.000、0.044、0.040、0.013、0.008)。

3 討 論

慢性胃炎、消化性潰瘍作為小兒消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，近年來(lái)發(fā)病率不斷升高，不僅給患兒身體帶來(lái)痛苦，而且可對(duì)患兒生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[9]。Hp作為一種在胃黏膜中寄生的需氧細(xì)菌，與慢性胃炎、消化性潰瘍等胃部疾病的發(fā)病密切相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，兒童期是Hp感染的高發(fā)期，感染率高達(dá)50%左右。但Hp致病的具體機(jī)制尚未完全清楚[11]。有研究指出，免疫炎性反應(yīng)與Hp感染致病有關(guān)[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Hp感染小鼠胃黏膜組織中細(xì)胞因子改變[13]。本研究結(jié)果顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平均高于非感染組，說(shuō)明Hp感染患兒胃黏膜組織中炎癥因子水平升高，可能參與了Hp所致胃病發(fā)病過(guò)程，與MICHALKIEWICZ等[14]研究結(jié)果相同。

miRNA作為機(jī)體內(nèi)重要的非編碼RNA，在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究指出，miR-146a作為一種miRNA，是重要的固有免疫信號(hào)調(diào)節(jié)分子，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[15]。miR-146a在強(qiáng)直性脊柱炎[16]、膿毒血癥患兒[17]外周血中表達(dá)上調(diào)。本研究原位雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-146a表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a陽(yáng)性表達(dá)率高于非感染組，說(shuō)明miR-146a在Hp感染患兒胃黏膜組織中呈高表達(dá)，可能參與了Hp感染致病過(guò)程。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a相對(duì)表達(dá)量高于非感染組，進(jìn)一步說(shuō)明miR-146a可能參與了Hp感染感染致病過(guò)程。研究表明，miR-146a主要調(diào)控Toll樣受體(TLR)2和TLR4通路，進(jìn)而可誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路活化而促進(jìn)炎癥因子及促炎信號(hào)通路的激活[18]。趙娜等[19]指出，miR-146a可能是通過(guò)調(diào)控TLR4信號(hào)通路中相關(guān)分子表達(dá)而參與細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV2炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于非感染組，說(shuō)明TLR4/NF-κB信號(hào)通路可能參與了Hp感染致病過(guò)程。相關(guān)分析結(jié)果顯示，Hp感染組患兒胃黏膜組織中miR-146a相對(duì)表達(dá)量與TLR4 mRNA和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平均呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明miR-146a可能通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)而在Hp感染致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，Hp感染患兒胃黏膜組織中miR-146a呈高表達(dá)，可能通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與了Hp感染致病過(guò)程，但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究明確，有望為Hp感染綜合防治提供新的靶位。