宮頸癌患者Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)及其預(yù)后意義

季 菲，何 艷，楊 麗，丁 巖，杜 蓉

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830054)

宮頸癌是目前女性患者易發(fā)的惡性腫瘤。目前研究認(rèn)為高危型人乳頭瘤病毒(HPV) 感染可促進(jìn)宮頸癌病變發(fā)生，正常情況下患者具有一定的抵抗病毒感染的能力，但部分患者在HPV的刺激下會產(chǎn)生宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)，并可能惡化發(fā)展為宮頸癌，這表明患者的免疫功能對宮頸癌的發(fā)病有重要的調(diào)控作用[1]。患者的臨床癥狀主要表現(xiàn)為經(jīng)期不調(diào)、接觸性出血、陰道炎[2]。因此研究宮頸癌的特異性臨床癥狀與影響臨床預(yù)后的因素對患者的治療有重要價值。已有研究表明，T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)的細(xì)胞免疫對機(jī)體產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞有調(diào)控作用[3-4]。輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)可分泌多種淋巴因子，能增強(qiáng)其他種類的免疫細(xì)胞活性，提升機(jī)體的整體免疫功能，可以協(xié)調(diào)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對免疫反應(yīng)的抑制作用[5]。本研究通過研究宮頸癌患者血清中Th1/Th2細(xì)胞因子與宮頸癌的臨床相關(guān)性，以期為宮頸癌患者的臨床治療提供一定的指導(dǎo)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2017年6月在本院接受治療的90例宮頸癌患者，患者經(jīng)術(shù)前宮頸活檢證實且在術(shù)后通過病理切片分析確診，年齡27～61歲，平均(42.5±9.7)歲。依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的患者分別是31、37、22例，以患者的臨床分期進(jìn)行分組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)入選患者未經(jīng)放療及化療治療，均為首次在本院確診并接受抗腫瘤治療；(2)患者知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者在其他單位確診并接受過抗腫瘤治療；(2)患者合并其他重大代謝疾病，如肝功能異常、糖尿病、心血管疾病等。同時選取本院同期體檢的30例健康女性作為對照組。

1.2主要試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；抗人白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4和抗人干擾素(IFN)-γ抗體購自美國eBioscience公司；HPV DNA引物購自上海生工生物公司；AccuriTMC6流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；超純水系統(tǒng)購自美國MILLIPORE公司；iMark酶標(biāo)儀購自美國伯樂公司；超低溫冰箱購自日本三洋公司；光學(xué)顯微鏡購自德國Leica公司；A550石蠟切片機(jī)購自德國MEDITE公司。

1.3方法

1.3.1HPV亞型檢測 取宮頸癌患者的宮頸上皮細(xì)胞收集液1.2 mL，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后，加入細(xì)胞裂解液120 μL，混勻后100 ℃ 10 min，按照DNA提取說明書分離HPV DNA備用。依據(jù)待檢的HPV基因特點(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33)設(shè)計相應(yīng)的PCR引物，采用PCR擴(kuò)增不同的HPV基因片段，按照HPV分型試劑盒說明書與相應(yīng)的分型探針雜交，判讀宮頸癌患者感染的HPV亞型。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測宮頸癌患者外周血Th1/Th2細(xì)胞比例 對宮頸癌患者空腹靜脈取血6 mL，并加入EDTA抗凝處理，以1 500 r/min離心10 min，取上清液冷凍保存?zhèn)溆谩㈦x心后的血細(xì)胞加入等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)，均勻稀釋后加入淋巴細(xì)胞分裂液，1 500 r/min離心20 min，下層為血細(xì)胞，上層主要為血漿，中層液體呈白色霧狀，即為單個核細(xì)胞層(PBMC)，將其置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，分別采用IFN-γ-APC、IL-4-PE-cy5對其進(jìn)行Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞表面標(biāo)記，洗滌后棄上清液，用PBS洗滌2次后，PBS 200 μL重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3免疫組織化學(xué)試驗 組織標(biāo)本采用甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋。對石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，厚度為4 μm，溫水展開后置于玻片上，65 ℃烤片30 min，然后依次置于二甲苯和梯度濃度的乙醇中水化，加入抗原修復(fù)液后微波爐烘烤15 min，加入3%過氧化氫液阻斷內(nèi)源性過氧化物，最后采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，最后中性樹脂封片，由經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師評估IL-2、IL-4、IFN-γ水平。

1.3.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清的相關(guān)淋巴因子 按照ELISA試劑盒說明書處理樣品，每孔50 μL血清樣品，將反應(yīng)板在37 ℃孵育60 min。然后采用洗滌液清洗反應(yīng)板3次后，加入相應(yīng)酶標(biāo)抗體試液50 μL孵育30 min，用洗滌液清洗后加入底物工作液50 μL反應(yīng)20 min，最后加入60 μL終止液，操作酶標(biāo)儀讀取樣品的吸光度值(A值)。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌患者HPV亞型分布 在誘發(fā)宮頸癌的前4位HPV亞型感染率方面，宮頸癌患者HPV亞型分布與對照組相比有明顯差異(P<0.05)。不同F(xiàn)IGO分期患者HPV亞型分布有明顯差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組HPV亞型分布特點[n(%)]

a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與Ⅰ期比較；c：P<0.05,與Ⅱ期比較

表2 各組外周血中Th1、Th2細(xì)胞的比例

a:P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與Ⅰ期比較；c：P<0.05,與Ⅱ期比較

A：對照組；B：Ⅰ期；C：Ⅱ期；D：Ⅲ期；其中分析時采用CD4+細(xì)胞設(shè)門，F(xiàn)ITC-CD4+和PE-IFN-γ+雙陽性細(xì)胞即Th1細(xì)胞表示。A、B、C和D圖中第1象限百分?jǐn)?shù)表示對照組、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者外周血中Th1細(xì)胞的頻率

A：對照組；B：Ⅰ期；C：Ⅱ期；D：Ⅲ期；其中分析時采用CD4+細(xì)胞設(shè)門，F(xiàn)ITC-CD4+和PE-IL-4+雙陽性細(xì)胞即Th2細(xì)胞表示。A、B、C和D圖中第1象限百分?jǐn)?shù)表示對照組、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者外周血中Th2細(xì)胞的頻率

2.2患者外周血中Th1、Th2細(xì)胞比例 Th1與Th2細(xì)胞比例在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者間比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中Th1細(xì)胞在Ⅰ期患者中比例較高(P<0.05)。Th2細(xì)胞比例在Ⅲ期患者中比例較高(P<0.05)。見表2，圖1、2。

2.3免疫組織化學(xué)方法檢測組織標(biāo)本中免疫因子的表達(dá) IFN-γ、IL-2在Ⅲ期患者中的陽性率為31.8%、36.7%，較對照組下降較大(P<0.05)；Ⅲ期患者IL-4的陽性率為72.7%，與對照組相比上升較大(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 各組標(biāo)本組織中IFN-γ、IL-2、IL-4的表達(dá)水平檢測[n(%)]

a:P<0.05，與對照組比較

圖3 各組標(biāo)本中IFN-γ、IL-2、IL-4表達(dá)的典型代表圖(×200)

2.4不同F(xiàn)IGO分期患者中各免疫因子表達(dá)水平的比較 Ⅲ期患者IL-4水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)；Ⅱ期患者IFN-γ、IL-2水平低于Ⅰ期患者(P<0.05)。不同F(xiàn)IGO分期患者IFN-γ、IL-2水平均低于對照組(P<0.05)，IL-4水平均高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 ELISA檢測各組血清中IFN-γ、IL-2、IL-4的表達(dá)水平

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與Ⅲ期比較；c:P<0.05，與Ⅰ期比較

3 討 論

宮頸癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要是患者的遺傳背景和外界生活環(huán)境等因素在特定條件下誘發(fā)的。Th是可以合成多種免疫因子的淋巴細(xì)胞，近年來越來越多的研究關(guān)注Th在人體免疫系統(tǒng)發(fā)揮的功能。免疫因子在體內(nèi)可以發(fā)揮多種細(xì)胞學(xué)功能，如促進(jìn)相關(guān)的淋巴細(xì)胞分化和成熟[7]。同時各類免疫因子在體內(nèi)可相互調(diào)節(jié)和制約，有效穩(wěn)定體內(nèi)免疫功能。有研究發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞亞群細(xì)胞因子水平上升,可干擾體內(nèi)的細(xì)胞免疫功能，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。Th1細(xì)胞亞群分泌IFN-γ和IL-2，可有效刺激細(xì)胞免疫活力，當(dāng)Th1功能較強(qiáng)時，機(jī)體的細(xì)胞免疫可有效抑制腫瘤細(xì)胞的活力[8]。Th2主要分泌IL-4等細(xì)胞因子，可參與體液免疫反應(yīng)，體內(nèi)分泌較多的Th2細(xì)胞因子后，細(xì)胞免疫的抗腫瘤能力受到削弱，Th1/Th2失衡可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生逃避免疫監(jiān)視，誘發(fā)患者病情惡化，通過檢測Th1/Th2細(xì)胞因子分泌水平，可分析Th1/Th2細(xì)胞亞群功能狀態(tài)[9]。因此，探討宮頸癌患者相關(guān)淋巴細(xì)胞免疫活性的變化可為宮頸癌的治療夯實理論基礎(chǔ)。

目前臨床研究表明，HPV感染和宮頸癌病變密切相關(guān)[10]。PENG等[10]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組患者高危型HPV感染率可達(dá)85.45%，HPV干擾淋巴細(xì)胞的正常功能，刺激宮頸上皮細(xì)胞的異常增殖。HANPRASERTPONG等[11]研究發(fā)現(xiàn)在胃腸道腫瘤患者不同Th細(xì)胞比例的變化與癌基因相關(guān)的特異轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)有密切關(guān)系，進(jìn)而參與調(diào)控腫瘤信號通路。孟建華[12]通過流式細(xì)胞術(shù)，檢測了103例宮頸癌患者外周血中的Th1/Th2比例，發(fā)現(xiàn)分化等級較高的宮頸癌患者Th1比例下降，Th2比例上升。本研究發(fā)現(xiàn)，Th1細(xì)胞比例在Ⅰ期宮頸癌患者中較高，Th2細(xì)胞比例在Ⅲ期宮頸癌患者中較高，這與以往研究一致[13-14]。通過免疫組織化學(xué)試驗發(fā)現(xiàn)IFN-γ、IL-2在Ⅲ期患者中的陽性率分別為31.8%、36.7%，較對照組下降明顯，患者腫瘤分級上升，IFN-γ、IL-2陽性率逐步下降，IL-4陽性率逐步上升。BREBI等[15]在研究宮頸癌前病變和宮頸癌組織中IFN-γ、IL-2等淋巴因子表達(dá)水平變化時，發(fā)現(xiàn)其與患者病程變長和臨床分期升高呈負(fù)相關(guān)，這與本研究一致。張曉姍等[16]發(fā)現(xiàn)Th1可合成并分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，可促使免疫功能紊亂，削弱免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的殺傷能力；Th2可合成分泌IL-4因子，促使Th1/Th2細(xì)胞因子分泌失衡，引起宮頸上皮細(xì)胞分裂周期失控，與本研究結(jié)果一致。梁毓等[17]在胃癌患者的外周血中檢測到IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子水平的降低，IFN-4水平的上升，刺激患者NK細(xì)胞水平下降，從而削弱患者的免疫功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。有研究表明，IFN-γ、IL-2可調(diào)控促癌基因的異常表達(dá)，加速癌細(xì)胞的增殖[18]。本研究通過ELISA發(fā)現(xiàn)Ⅲ期宮頸癌患者血清中IL-4水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)；Ⅲ期患者IFN-γ、IL-2水平低于Ⅰ期和Ⅱ期患者(P<0.05)。已有研究發(fā)現(xiàn)患有肺癌、乳腺癌或胃癌等腫瘤的患者Th1/Th2比例異常，引起其分泌的免疫因子水平有較大的變化，對腫瘤細(xì)胞的生長有較大的刺激作用，可增強(qiáng)其免疫逃避的功能，這表明Th1、Th2分泌的細(xì)胞因子與腫瘤異常生長有內(nèi)在聯(lián)系，這與本研究一致[19]。本研究的數(shù)據(jù)表明，Th1/Th2細(xì)胞因子可反映患者的免疫功能狀態(tài)，有助于患者的臨床診斷。同時需研究Th1/Th2細(xì)胞因子影響腫瘤細(xì)胞免疫逃避的具體機(jī)制，為相關(guān)抗腫瘤藥物開發(fā)提供試驗支持。

綜上所述，宮頸癌患者Th1/Th2比例異常，Th1分泌的IFN-γ、IL-2水平下降，Th2分泌的IL-4水平上升，與宮頸癌的病變關(guān)系密切，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。