鹽酸川芎嗪對(duì)人肝癌細(xì)胞及外泌體蛋白GPC3的影響

劉振華，王 寧，李克躍，湯可立，石承先，丁 杰，王飛清

(1.貴州省人民醫(yī)院肝膽外科，貴陽(yáng) 550002 ；2.貴州省骨科醫(yī)院藥劑科，貴陽(yáng) 550004； 3.貴州省人民醫(yī)院胃腸外科，貴陽(yáng) 550002；4.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽(yáng) 550001)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌最常見的類型，占80%～90%，是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。盡管在預(yù)防、篩查、診斷和治療手段等方面已經(jīng)取得了一定進(jìn)步，但是肝癌的發(fā)病率和病死率仍持續(xù)上升，且患者的5年生存率仍低于20%[2-3]。外泌體作為生物信息交換的物質(zhì)運(yùn)載體并通過(guò)遞送一系列生物分子(包括蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和核酸)在調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境中起重要作用。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體參與了細(xì)胞間的信息溝通、腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移及放化療抵抗的形成[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體蛋白磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族中的一員,通過(guò)磷脂酰肌醇錨定連接于細(xì)胞表面，與細(xì)胞的增殖、分化、黏附和遷移關(guān)系密切，與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，在肝癌組織及肝癌患者血清中異常表達(dá)[7-8]。川芎嗪(TMPH)是從中藥川芎中分離得到的有效單體成分，因其不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用較為廣泛，具有一定的抗肝癌作用[9-11]，然而其作用機(jī)制不完全清楚。本文探索川芎嗪對(duì)肝癌細(xì)胞外泌體中GPC3及肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，為臨床使用川芎嗪治療HCC提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H、HepG2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，注射用鹽酸川芎嗪(TMPH，北京四環(huán)科寶制藥有限公司，批號(hào)14032015)用DMEM培養(yǎng)液溶解為1.0 mg/mL質(zhì)量濃度，0.22 μm濾器除菌，臨用時(shí)配制。兔抗GPC3 (379-393aa)抗體為美國(guó)Bioworld Technology公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1MHCC97-H、HepG2細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞用高糖 DMEM 培養(yǎng)基+10%胎牛血清(FBS)；置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞密度達(dá)到 80%左右，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理。

1.2.1.2細(xì)胞間接共培養(yǎng)MHCC97-H、HepG2 高糖 DMEM 無(wú)血清培養(yǎng)基，上室接種5×104個(gè)/mL MHCC97-H，下室接種2.5×105個(gè)/mL HepG2，共培養(yǎng)72 h后，下室HepG2細(xì)胞用于后續(xù)的遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 待MHCC97-H、共培養(yǎng)細(xì)胞和HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)至最佳，1×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于24孔板，次日長(zhǎng)滿后，用20 μL的加樣槍頭輕輕劃一痕，新鮮不含血清培養(yǎng)基饑餓4 h后加入TMPH(1.0 mg/mL)處理各細(xì)胞系24 h。0、24 h測(cè)量劃痕寬度算出細(xì)胞遷移距離，并計(jì)算遷移率。

1.2.4Western blot檢測(cè)外泌體GPC3表達(dá) 制備各組細(xì)胞懸液， 以 2×107個(gè)/mL細(xì)胞數(shù)接種于 T75 培養(yǎng)瓶中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜;棄舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍。加新鮮不含血清培養(yǎng)基，細(xì)胞饑餓4 h后加入TMPH處理各細(xì)胞系，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液，利用超速離心法提取上清液中的外泌體蛋白。二喹啉甲酸(BCA)蛋白樣品定量各組后，用上樣緩沖液進(jìn)行樣品制備，上樣行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，甲醇浸泡后，室溫干燥固化膜上蛋白，再水化后用5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗后用二抗室溫孵育2 h，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀成像觀察GPC3水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GPC3蛋白在MHCC97-H、HepG2上清液中的表達(dá) 在兩種肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中均可檢測(cè)到GPC3，且與HepG2相比，MHCC97-H上清液中GPC3水平明顯較高(圖1A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。

A：Western blot檢測(cè)GPC3蛋白；B：GPC3半定量統(tǒng)計(jì)圖；C：Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞GPC3蛋白量；D：3組細(xì)胞GPC3蛋白半定量統(tǒng)計(jì)圖；E：3組細(xì)胞劃痕比較；F:3組細(xì)胞遷移率統(tǒng)計(jì)圖；G:3組細(xì)胞侵襲能力比較；H:3線細(xì)胞侵襲A值統(tǒng)計(jì)圖；a：P<0.01，與HepG2比較；b:P<0.01，與對(duì)照組比較；“-”為對(duì)照組，“+” 為TMPH組

2.2TMPH處理各組細(xì)胞后上清液外泌體中GPC3的變化 共培養(yǎng)細(xì)胞HepG2上清液中外泌體蛋白GPC3較常規(guī)培養(yǎng)的HepG2明顯增高；3組細(xì)胞經(jīng)TMPH處理24 h后(TMPH組)，除HepG2組外，上清液中的外泌體蛋白GPC3均較未處理組(對(duì)照組)有明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01，圖1C、D)。

2.3TMPH對(duì)常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞、共培養(yǎng)肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響 經(jīng)TMPH處理24 h的MHCC97-H、HepG2-coculture遷移、侵襲能力明顯下降，其遷移率(圖1E、F)、穿膜細(xì)胞數(shù)A值(圖1G、H)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

HCC是一種高度惡性的腫瘤，其轉(zhuǎn)移與所處微環(huán)境關(guān)系密切。外泌體攜帶來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的特異性生物標(biāo)志物，其水平與腫瘤細(xì)胞侵襲能力和腫瘤微環(huán)境相關(guān)。由于外泌體的保護(hù)性脂質(zhì)膜，其DNA、RNA和蛋白質(zhì)不易降解，且外泌體可以從許多體液中獲得，使外泌體的檢測(cè)可能是“液體活檢”的理想方法[12]。研究發(fā)現(xiàn)，GPC3通過(guò)糖基-磷脂酰肌醇錨定與細(xì)胞膜結(jié)合，在培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)基中可以檢測(cè)到GPC3蛋白[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與HepG2相比，MHCC97-H上清液外泌體中GPC3蛋白水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)TMPH處理24 h后，GPC3水平明顯下降。

外泌體通過(guò)囊泡內(nèi)容物傳遞信息，被認(rèn)為是細(xì)胞間的第3種信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制[14]。在生理?xiàng)l件下，外泌體的內(nèi)容物被供體細(xì)胞精確地調(diào)節(jié)并反映供體細(xì)胞的功能。為了在細(xì)胞之間交換和傳遞生物信息，供體細(xì)胞通過(guò)外泌體的“運(yùn)輸”功能將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞[15]。在病理?xiàng)l件下，病變細(xì)胞也可以將病毒、miRNA等內(nèi)容轉(zhuǎn)移到正常細(xì)胞，使正常細(xì)胞感染導(dǎo)致細(xì)胞病變[16]，或?qū)┗蜣D(zhuǎn)移至正常細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與高轉(zhuǎn)移能力肝癌細(xì)胞系MHCC97-H共培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，其侵襲、遷移能力明顯增強(qiáng)，經(jīng)TMPH處理后明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CAPURRO等[18]使用免疫組織化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)了HCC患者的GPC3蛋白表達(dá)和血清中GPC3水平，以及健康肝臟、肝炎和肝硬化患者血清中GPC3的水平，結(jié)果顯示HCC患者肝臟組織中GPC3表達(dá)水平增加，但在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)。HCC患者血清中GPC3水平顯著升高，而在健康體檢者和肝炎患者血清中檢測(cè)不到[18]。表明肝癌細(xì)胞能夠自分泌相關(guān)信號(hào)物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，這可能是肝癌細(xì)胞發(fā)生血液轉(zhuǎn)移的前提。研究發(fā)現(xiàn)，GPC3通過(guò)增加自分泌/旁分泌激活經(jīng)典Wnt信號(hào)刺激HCC細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長(zhǎng)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，GPC3能夠與Wnt形成復(fù)合物，表明GPC3通過(guò)促進(jìn)該多肽與其信號(hào)受體的相互作用來(lái)刺激Wnt活性[18]。這可能也是MHCC97-H細(xì)胞通過(guò)分泌GPC3促進(jìn)HepG2侵襲、遷移能力增強(qiáng)的原因。

川芎中提取的純化學(xué)物質(zhì)TMPH具有抗氧化、抗纖維化作用，能改變血液流變學(xué)、免疫抗腫瘤等功效。研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡及自噬等發(fā)揮抑癌作用[9]；也有研究表明TMPH直接殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制血管生成[19]，與調(diào)控TGF-β1/Smads通路[11]、調(diào)控Bax、Bcl-2基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞的凋亡及增殖周期有關(guān)[20]。本研究結(jié)果表明，TMPH可通過(guò)下調(diào)外泌體中GPC3蛋白的表達(dá)水平，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，表明其抑制肝癌的機(jī)制可能與改變腫瘤的微環(huán)境、降低外泌體中GPC3表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，下調(diào)外泌體中GPC3蛋白改變腫瘤的微環(huán)境可能是TMPH抗肝癌機(jī)制之一。