小電導(dǎo)鈣激活鉀通道在人心房中的增齡性變化

余奕言，何容芳，于風(fēng)旭，范學(xué)慧，張 娟，李 濤，李妙齡△

(1.醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/醫(yī)學(xué)電生理四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所,四川瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心臟外科,四川瀘州 646000)

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation,AF)已成為全球重大的公共衛(wèi)生問題，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，直到2010年，全球AF患者已達(dá)到33.5億[1]。且除了AF自身的危害以外，還會(huì)增加卒中及心力衰竭的發(fā)病率以及致死率。AF是臨床最為常見的持續(xù)性心律失常，一般人群發(fā)病率為1%～2%，80 歲以上可高達(dá)8%。在所有AF患者中，70%的AF患者年齡在65～85 歲。對(duì)1999-2001年我國(guó)AF住院患者病因分析顯示，老年58.1%、高血壓病40.3%、冠心病34.8%、心力衰竭33.1%、風(fēng)濕性心臟病23.9%；陣發(fā)性AF占33.7%、持續(xù)性AF占16.7%、永久性AF占49.5%[2]。老年和高血壓所占比例排前兩位，是AF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

小電導(dǎo)鈣激活鉀(SK2)通道是近期發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣敏感的一類鈣激活鉀通道[3]。SK2通道主要在心房上表達(dá)，在心房復(fù)極末期發(fā)揮重要作用。眾多研究支持SK通道的結(jié)構(gòu)與功能變化與AF的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[4-7]，參與了AF電重構(gòu)過程。本課題組前期研究報(bào)道，AF時(shí)SK通道的功能明顯增強(qiáng)[8]。AF的發(fā)生隨年齡增加明顯增加，因此本研究旨在探究是否隨著年齡的增加，SK2通道功能會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而增加AF的發(fā)生率，為闡明AF的發(fā)生和治療提供新的思路和新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1取材 選取在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心臟外科進(jìn)行體外循環(huán)的不同年齡段(<40歲、40～60歲、>60歲)竇性心律(SR)患者的新鮮右心耳組織。所有受試者均簽署知情同意書，且獲得西南醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的同意，所有程序均遵照國(guó)內(nèi)相關(guān)法律法規(guī)。

1.1.2主要試劑 Ⅴ型膠原酶、ⅩⅩⅣ型膠原酶、牛血清清蛋白、Apamin均購(gòu)于Sigma公司，Rever Tra Ace q RT-PCR Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Toyobo公司，SYBR Green定量PCR試劑盒購(gòu)于Qiagen公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器 低溫高速離心機(jī)購(gòu)于Thermo Fisher公司，PCR儀、Real-time PCR儀購(gòu)于Applied Biosystems公司，全功能酶標(biāo)儀購(gòu)于NanoDrop公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于Bio-Rad公司。微管電極拉制儀(PC-10，Narishige，日本)用于拉制玻璃微電極、膜片鉗放大器(EPC-10，HEKA，德國(guó))用于全細(xì)胞膜片鉗記錄。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人心房肌細(xì)胞急性酶分離方法 將手術(shù)室中快速取回的心房組織置于培養(yǎng)皿中氧飽和的心肌轉(zhuǎn)運(yùn)液(?；撬?10 mmol/L,腺苷 5 mmol/L,硫酸鎂8 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,磷酸二氫鉀50 mmol/L,甘露醇100 mmol/L,葡萄糖140 mmol/L,用氫氧化鉀調(diào)pH值至7.4)中清洗并將心房組織剪為約1 mm3的小塊，再將組織塊置于酶液Ⅰ(蛋白酶、膠原酶和牛血清清蛋白)于37 ℃水浴中消化約50 min，再將心房組織轉(zhuǎn)移至酶液Ⅱ(膠原酶、清蛋白)中進(jìn)行消化，隨時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)，一般約5～8 min，低倍視野下出現(xiàn)3～5個(gè)細(xì)胞即可終止酶液Ⅱ消化，重復(fù)酶Ⅱ消化3次。以上所有過程均保持組織處于持續(xù)充氧狀態(tài)。收集3次消化的酶液并離心5 min (500 r/min)，離心后去除上清液加入KB液 (?；撬?0 mmol/L,β-羧基丁酸10 mmol/L,磷酸二氫鉀10 mmol/L,氯化鉀20 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,甘露醇5 mmol/L,葡萄糖 25 mmol/L,谷氨酸鉀 70 mmol/L,清蛋白1 mg/mL,用氫氧化鉀調(diào)pH值至7.4) 重懸后4 ℃保存，1 h后可用于電生理實(shí)驗(yàn)[9]。

1.2.2全細(xì)胞膜片鉗技術(shù) 倒置相差顯微鏡下選取呈桿狀、橫紋清楚、無收縮且貼壁良好的心房肌細(xì)胞進(jìn)行電生理的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)電極選用硬質(zhì)玻璃且用微管電極拉制儀通過兩步法拉制而成，充灌電極后電極阻抗為2～5 Ω。采用膜片鉗放大器(EPC-10，HEKA)記錄電流信號(hào)，用Patch Master軟件采集數(shù)據(jù)，采樣頻率為10 kHz，低通濾波頻率為2 kHz。記錄SK通道電流(ISK)，電流保持電位-60 mV，指令電壓從-130 mV到+60 mV，Ramp刺激時(shí)間持續(xù)500 ms。可記錄到一內(nèi)向整流特性的鉀電流,在此基礎(chǔ)上加入SK通道特異性阻斷劑Apamin后電流明顯減小，加藥前后相減的電流為SK通道電流。記錄電流的細(xì)胞外液(N甲基氨基葡萄糖 140 mmol/L,氯化鉀 4 mmol/L,氯化鎂 1 mmol/L,葡萄糖 5 mmol/L,HEPES 10 mmol/L，用鹽酸調(diào)pH值至7.4)；電極液 (葡萄酸鉀144 mmol/L,氯化鎂 1.55 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 5 mmol/L，用氫氧化鉀調(diào)至7.2)。

1.2.3Western blot檢測(cè)心房組織中SK2通道蛋白的表達(dá)

1.2.3.1總蛋白的提取 將獲取的心房組織剪碎清洗，液氮研磨后加入RAPI裂解液(含蛋白酶抑制劑)在冰上裂解30 min，再用細(xì)胞破碎儀處理2 min。 4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。用BCA法測(cè)蛋白濃度后加入5×Loading Buffer 99 ℃變性10 min 置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2Western blot 制備分離膠與濃縮膠，待膠凝固后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗4 ℃孵育過夜。第二天室溫孵育二抗1 h。再用TBST清洗，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)顯影，采用Quantity One 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)心房組織中KCNN2基因的表達(dá)

1.2.4.1組織RNA提取 將獲取的心房組織剪碎清洗，加入Trizol后用液氮研磨，加入氯仿后渦旋振蕩混勻，室溫靜置5 min后離心。離心后取出上層水相并加入異丙醇離心后沉淀RNA。棄上清液，加入75%乙醇清洗后揮干，加入DEPC水吹打混勻，用全功能酶標(biāo)儀檢測(cè)mRNA水平。

1.2.4.2引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中KCNN2、β-actin的引物序列來設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。

表1 KCNN2及β-actin引物序列

1.2.4.3逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的第一鏈 將RNA統(tǒng)一標(biāo)化為500 ng/μL，用Toyobo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取1 μL總RNA，反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.2.4.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 熒光定量采用SYBR Green(QIAGEN公司)試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，57℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1病歷資料 本研究中<40歲組患者22例，40～60歲組患者34例和>60歲組患者18例，<40歲組的患者中主要以先天性心臟病(簡(jiǎn)稱先心病)為主，而40～60歲組和>60歲組患者主要以二尖瓣或主動(dòng)脈瓣病變?yōu)橹?，各組心臟的基礎(chǔ)性疾病及用藥的差異，見表2。

表2 患者資料

續(xù)表2 患者資料

相同年齡段患者心房組織存在共用情況，故導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)中例數(shù)不完全一致

2.2急性酶分離的心肌細(xì)胞 兩步酶法分離出的人心房肌細(xì)胞在顯微鏡下呈桿狀，細(xì)胞膜光滑，折光性好，橫紋清楚，不收縮，活性好(圖1A)；細(xì)胞表面光滑平整或有一處多處小凹陷(圖1B)，但并不影響封接破膜，均適宜做下一步的膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

A:橫紋清晰的人心房肌細(xì)胞；B：細(xì)胞有凹陷的人心房肌細(xì)胞

A:<40歲組加入Apamin 前后電流原始記錄圖； B:40～60歲組加入Apamin 前后電流原始記錄圖;C:>60 歲組加入Apamin 前后電流原始記錄圖;D：各組電流密度-電壓關(guān)系曲線(Ⅰ～Ⅴ曲線);加藥前后電流相減即為SK2通道電流

2.3老年患者心房肌細(xì)胞SK2通道電流的變化 記錄SK2通道電流的電極內(nèi)液的游離鈣離子濃度為5×10-7mol/L，保證SK通道的充分激活。<40歲組 (n=16個(gè)細(xì)胞,來自8例患者心房)與40～60歲組(n=20個(gè)細(xì)胞,來自8例患者心房)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，<40歲組與>60歲組(n=18個(gè)細(xì)胞，來自10例患者心房)比較，在多個(gè)膜電位水平(電壓從-130 mV到-80 mV、+50 mV到+60 mV)電流幅度明顯增加(P<0.01或P<0.05)。40～60歲組(n=20)與>60歲組(n=18)比較，在多個(gè)膜電位水平(電壓從-130 mV到-80 mV、+50 mV到+60 mV)電流幅度均明顯增加(P<0.01或P<0.05)。見圖2。

2.4人心房組織SK2蛋白的表達(dá) 與<40歲組(n=12)比較，40～60組(n=18)和>60歲組(n=10)SK2通道蛋白的表達(dá)均有所增加，但只有與>60歲組比較蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；40～60組(n=18)與>60歲組(n=10)比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

a：P<0.05

2.5熒光定量PCR檢測(cè)心房組織KCNN2基因的表達(dá)變化 熒光定量PCR結(jié)果顯示，與<40歲組(n=12)比較40～60歲組(n=18)和>60歲組(n=10)KCNN2基因表達(dá)均有所增加，但只有>60歲組KCNN2基因表達(dá)上調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；40～60歲組(n=18)和>60歲組(n=10)比較KCNN2基因表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

a：P<0.05

3 討 論

AF是臨床最為常見的心律失常，心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)是AF發(fā)生和維持的重要病理基礎(chǔ)。這些異常是由不同的病理生理學(xué)機(jī)制引起的，而AF發(fā)生的機(jī)制至今還未清楚。流行病學(xué)資料顯示AF的發(fā)生與患者的年齡密切相關(guān)，老齡很有可能是易于導(dǎo)致AF的重要原因，研究老齡患者的心房電重構(gòu)，對(duì)臨床上指導(dǎo)老齡患者用藥具有重要的參考價(jià)值。統(tǒng)計(jì)資料顯示，因心律失常住院的患者中，約1/3的人是因?yàn)锳F。對(duì)大多數(shù)人來說，40歲以后發(fā)生AF的風(fēng)險(xiǎn)接近25%[10],而且隨著年齡的增加風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)也隨之增加。盡管AF沒有帶來毀滅性的傷害，但是它會(huì)大大降低人們的生活質(zhì)量及增加腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[11-13]。多種臨床危險(xiǎn)因素如高齡、高血壓、糖尿病、吸煙、心衰、肥胖等，還有一些心電圖和超聲心動(dòng)圖的特性變化及一些生物化學(xué)的標(biāo)志蛋白的變化都與發(fā)生AF風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。而在2014年美國(guó)心臟協(xié)會(huì)心AF動(dòng)治療指南中，將高齡列為AF發(fā)生的第一危險(xiǎn)因素[14]。有研究表明，在<60歲的受試者中，AF的發(fā)生率男性為0.78%、女性為0.76%。而在≥60歲的受試者中，男性、女性AF的發(fā)生率均增加為1.83%[15]。

小電導(dǎo)鈣激活鉀通道是一類對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子敏感而對(duì)膜電位不敏感的鉀通道[16]。2007年OZGEN等[17]發(fā)現(xiàn)快速電刺激可導(dǎo)致SK通道蛋白從細(xì)胞內(nèi)向膜上轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致心肌復(fù)極加速，第一次提出SK參與心房電重構(gòu)。2009年LI等[18]研究發(fā)現(xiàn)，SK2基因敲除小鼠易發(fā)生AF，但卻沒有出現(xiàn)室性心律失常。2010年DINESS等[19]在乙酰膽堿結(jié)合電刺激誘發(fā)的AF模型上發(fā)現(xiàn)，AF發(fā)生后給予SK通道的阻滯劑可預(yù)防和終止AF的發(fā)生，且對(duì)心房具有明顯的靶向性。這些研究表明，SK通道在AF的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，小電導(dǎo)鈣激活鉀通道是新近發(fā)現(xiàn)在心臟中發(fā)揮重要功能作用的一類鉀通道。近年來，越來越多的人關(guān)注這類通道，因?yàn)樗赡茏鳛樾姆刻禺愋赃x擇的靶點(diǎn)。所以抑制SK通道的表達(dá)可能作為AF治療的新靶點(diǎn)[10]。

本研究結(jié)果表明，在急性酶分離的細(xì)胞中記錄到Apamin敏感的SK2電流。老年患者心房肌的SK2通道電流明顯增加，并伴隨著基因和蛋白的表達(dá)同時(shí)上調(diào)，表明隨著年齡的增加，SK2通道的功能明顯增強(qiáng)。從而為增齡與AF發(fā)生間的相關(guān)性提供了新的依據(jù)。隨著年齡的增加，心房SK2通道表達(dá)增加，可能是引起AF發(fā)生存在的底物，其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的探索。本研究未選取動(dòng)物模型作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，而是直接選取臨床上3個(gè)年齡階段(<40歲、40～60歲和>60歲)竇性心律患者的心房組織，更具有臨床指導(dǎo)意義。為探究高齡與AF間關(guān)系的機(jī)制提供新的思路，為AF的治療和預(yù)防提供新的方向。