膀胱癌中巨噬細胞浸潤與膀胱癌化療耐藥的研究

康川疆，周艷，姜睿

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 泌尿外科，四川 瀘州 646000；2.四川省遂寧市第三人民醫(yī)院 兒科，四川 遂寧 629000）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一，因其發(fā)病率高、術(shù)后復(fù)發(fā)率高以及致死率高等特點導(dǎo)致膀胱癌治療頗為困難[1]。膀胱癌微環(huán)境在腫瘤進展和治療中發(fā)揮重要功能[2]，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor associated macrophages, TAMs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，相對于癌旁組織，腫瘤組織中腫瘤相關(guān)巨噬細胞明顯增加，被激活為M2型巨噬細胞后釋放大量細胞因子，促進膀胱癌的進展[3]。

趨化因子生長調(diào)節(jié)基因5[chemokine（C-X-C motif）ligand 5, CXCL5]屬于趨化因子CXC中ELR趨化因子的一員，最新研究發(fā)現(xiàn)CXCL5具有促進腫瘤增殖、血管形成、粒細胞趨化及促進炎癥反應(yīng)等功能[4-5]，本研究旨在探究膀胱癌通過分泌CXCL5招募巨噬細胞以及巨噬細胞對膀胱癌化療耐藥性的影響，為膀胱癌治療提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1、人膀胱癌細胞系T24、253J及人急性單核細胞白血病細胞系THP-1細胞購自中國科學(xué)院昆明細胞庫，DMEM培養(yǎng)基和RMPI-1640培養(yǎng)基購于美國Life Technologies公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，佛波酯（phorbol 12-myristste 13-acetate, PMA）、IL-4購自美國Sigma-Aldrich公司，Transwell小室購自美國Coming公司，F(xiàn)ibronectin購自美國Life Technologies公司，RNA提取試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司，RNA反轉(zhuǎn)試劑盒及PCR kit購自日本TaKaRa公司，CXCL5敲減shRNA慢病毒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，CXCL5多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，PARP/cleaved-PARP購自美國Cell Signaling Technology （CST）公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染

膀胱癌細胞T24、253J使用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1和急性單核細胞白血病細胞系THP-1細胞使用含10%胎牛血清RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)加入100 μg/ml青霉素和鏈霉素（Sigma, USA），置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱，每2～3天對細胞換液處理，貼壁細胞每4～5天通過胰酶消化進行傳代處理，THP-1細胞離心重懸進行傳代處理。每次實驗前使用160 nmol/L PMA細胞培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)THP-1細胞分化成巨噬細胞。shRNA慢病毒預(yù)實驗感染確定T24細胞MOI值為5、253J細胞MOI值為10。調(diào)整細胞密度將T24、253J細胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染前用DMEM培養(yǎng)液清洗細胞，使用Complete Mdeium稀釋polybrene至終濃度50 μg/ml，細胞加入5 μg/ml的polybrene和相應(yīng)體積病毒轉(zhuǎn)染T24、253J細胞48 h后，使用2～3 μg/ml嘌呤霉素進行細胞篩選2～3周，熒光顯微鏡下檢測熒光蛋白表達，實時熒光定量PCR和Western blot檢測CXCL5的mRNA和蛋白表達。

1.3 人正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞條件培養(yǎng)基提取

人正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞正常培養(yǎng)，胰酶消化離心后重懸，調(diào)整細胞數(shù)量為2.0×106個/皿接種于10 cm皿中，待細胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基，將10 cm皿置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，吸取細胞上清液離心去除細胞碎屑，吸取離心后上清液置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 THP-1源性巨噬細胞條件培養(yǎng)基提取

THP-1細胞離心重懸，細胞計數(shù)并按2.0×106個/皿接種于10 cm皿中，PMA誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，更換新的培養(yǎng)基，再加入20 ng/ml的IL-4繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，吸取細胞上清液離心去除細胞碎屑，吸取離心后上清液置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測膀胱癌細胞增殖能力變化

膀胱癌細胞正常培養(yǎng)，待細胞生長至70%～80%消化進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為3.0×105個/ml，按照每孔200 μl接種于96孔板中，待細胞貼壁后實驗組按照1∶1比例加入巨噬細胞條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)36 h，加入濃度為2.0 μmol/L多柔比星，每種處理設(shè)置5個復(fù)孔，將96孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸去上清液，每孔加入含有10% MTT的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，吸去上清液加入150 μl DMSO/孔，置于微量振蕩器勻速振蕩10 min，對照組未加入巨噬細胞條件培養(yǎng)基。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測光密度（OD）值，做出細胞生長曲線。

1.6 THP-1細胞招募實驗

取5μm Transwell小室，倒置放置于10 cm皿中，小室下室膜上滴加20 μl Fibronectin并均勻鋪滿，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中4～6 h備用。THP-1正常培養(yǎng)，離心后使用無血清培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞密度為2.5×105個/ml，取出已包被Fibronectin的小室取出置于24孔板中，小室下室加入1∶1稀釋的無血清條件培養(yǎng)基，上室加入200 μl的THP-1細胞懸液，將24孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，棉簽擦拭小室上室細胞，使用4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗加入結(jié)晶紫染色20 min，再次使用PBS清洗小室并使用棉簽擦拭上室殘留細胞，顯微鏡隨機選取5個視野拍照，實驗重復(fù)3次。

1.7 實時熒光定量PCR檢測相關(guān)mRNA表達

使用胰酶消化并傳代細胞接種于6孔板中，待細胞密度至60%～70%時按照飛捷RNAfast 200試劑說明書操作提取RNA，cDNA模板通過RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得，逆轉(zhuǎn)錄體系參照TaKaRa Prime ScriptTMRT Master Mix試劑說明書。CXCL5的mRNA表達檢測使用TaKaRa SYBR @ PrimixEx TaqTMⅡ反應(yīng)體系，引物序列：正向5'-GACGGTGGAAACAAGGAAAA-3'，反向5'-GCTTAAGCGGCAAACATAGG-3'。使用β-actin作為內(nèi)參，正向5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，反向5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。mRNA的表達水平采用2-△△Ct計算方法進行分析。T24和253J兩種細胞系未加入CXCL5敲減shRNA慢病毒作為對照。

1.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達

使用胰酶消化并傳代細胞接種于6孔板中，待細胞密度至60%～70%時加入細胞裂解液提取蛋白，使用BCA法測定所提取蛋白濃度。取30μg蛋白使用SDS-PAGE凝膠進行分離并轉(zhuǎn)膜處理，PVDF膜使用5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入目的抗體CXCL5、PARP/cleaved-PARP、β-actin，放置在4℃冰箱搖床慢搖過夜孵育。使用TBST洗膜液洗膜10 min×3次，加入二抗孵育，并置于常溫搖床1 h，TBST洗膜液洗膜10 min×3次，使用ECL顯影液進行顯影。目的蛋白表達量通過與內(nèi)參蛋白β-actin標準化后得到相對比值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，對計量資料組間比較采用多因素方差分析及LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌細胞與正常膀胱上皮細胞招募THP-1細胞

SV-HUC-1組招募THP-1細胞數(shù)（85.400±5.528），膀胱癌細胞T24和253J組招募THP-1細胞數(shù)分別為（288.200±6.028）和（348.600±8.583），與正常膀胱上皮細胞比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=42.950和44.650，均P=0.000），顯示膀胱癌細胞相對正常膀胱上皮細胞招募更多的THP-1細胞。

2.2 膀胱癌細胞與正常膀胱上皮細胞CXCL5表達水平

T24組與253J組膀胱癌細胞CXCL5的mRNA表達水平分別為（5.871±0.345）、（6.238±0.472），與正常膀胱上皮細胞（1.000±0.413）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.680和14.470，均P=0.000），CXCL5在膀胱癌細胞中表達升高。見圖1。

圖1 SV-HUC-1、253J、T24細胞CXCL5蛋白表達情況

2.3 膀胱癌細胞CXCL5敲減對THP-1細胞浸潤的影響

敲減膀胱癌細胞CXCL5表達見圖2。膀胱癌細胞系T24敲低組招募THP-1細胞數(shù)，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。253J細胞敲低組招募THP-1細胞數(shù)，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），顯示CXCL5敲減抑制膀胱癌細胞對THP-1細胞招募能力。見表1。

2.4 THP-1源性巨噬細胞對膀胱癌對多柔比星抵抗性的影響

膀胱癌細胞系T24共培養(yǎng)組細胞存活率，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。253J共培養(yǎng)組細胞存活率，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），THP-1源性巨噬細胞共培養(yǎng)可以增強膀胱癌細胞對多柔比星的抵抗性。見表2。

圖2 T24、253J細胞CXCL5敲減后CXCL5蛋白水平

表1 膀胱癌細胞CXCL5敲減后招募巨噬細胞比較（±s）

表1 膀胱癌細胞CXCL5敲減后招募巨噬細胞比較（±s）

組別 招募細胞數(shù) t值 P值T24細胞系對照組 87.200±2.588 10.390 0.000 CXCL5敲低組 33.400±8.583 253J細胞系對照組 65.600±3.209 19.160 0.000 CXCL5敲低組 24.200±1.924

表2 THP-1源性巨噬細胞影響膀胱癌對多柔比星的抵抗性 （±s）

表2 THP-1源性巨噬細胞影響膀胱癌對多柔比星的抵抗性 （±s）

組別 細胞存活率/% t值 P值T24細胞系對照組 100.000±9.424 3.450 0.008共培養(yǎng)組 118.953±7.872 253J細胞系對照組 100.000±6.236 2.750 0.030共培養(yǎng)組 109.534±4.616

3 討論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中重要機制，TAMs在腫瘤進展中發(fā)揮重要功能，既往報道發(fā)現(xiàn)TAMs在腎癌[6]、肝癌[7]、肺癌等[8]多種惡性腫瘤疾病中浸潤增加，本研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中，膀胱癌細胞招募TAMs能力高于正常膀胱上皮細胞，TAMs很可能在膀胱癌惡性進展中起到關(guān)鍵作用。

CXCL5是CXC族趨化因子成員[9]，趨化因子主要作用是作為化學(xué)引誘物介導(dǎo)細胞特異性遷移，吸引相關(guān)炎癥細胞的組織浸潤。研究發(fā)現(xiàn)CXCL5在前列腺癌[10]、乳腺癌[11]、胰腺惡性腫瘤[12]和腎癌[13]中高表達，而有關(guān)CXCL5在膀胱癌中對TAMs招募作用尚未報道。本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞CXCL5表達高于正常膀胱上皮細胞，且CXCL5敲減能抑制膀胱癌細胞對THP-1細胞招募能力，說明CXCL5在膀胱癌細胞對THP-1細胞招募過程中發(fā)揮重要功能。

TAMs促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時TAMs高浸潤增強多種惡性腫瘤如乳腺癌或胃癌患者對化療藥物耐藥及引起預(yù)后不良[14-16]，因此筆者想要探討腫瘤相關(guān)巨噬細胞對膀胱癌細胞化療耐藥產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后加入多柔比星相對多柔比星對照組化療藥物對膀胱癌細胞殺傷作用明顯下降，說明腫瘤相關(guān)巨噬細胞可以促進膀胱癌細胞對多柔比星的化療耐藥性。

綜上所述，膀胱癌細胞通過分泌過多的CXCL5招募巨噬細胞，同時招募的腫瘤相關(guān)巨噬細胞能夠反向性作用于膀胱癌細胞，增強膀胱癌的化療耐藥性，對膀胱癌的治療提供了新的思路。