人睪丸特異表達(dá)基因PIAS-NY原核表達(dá)和多克隆抗體的制備*

王海燕，曾凡強(qiáng)，王玉蘭，鄭英，戚大石

（1.徐州醫(yī)科大學(xué) 人體解剖學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004；2.揚(yáng)州大學(xué) 組胚教研室，江蘇 揚(yáng)州 225001；3.徐州醫(yī)科大學(xué) 遺傳學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004）

睪丸特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是精子發(fā)生過程中最基本的調(diào)節(jié)因素[1]，具有進(jìn)化上高度保守、生精細(xì)胞特異表達(dá)或高表達(dá)及階段特異性表達(dá)的特征[2-3]。因此篩選并研究這些差異表達(dá)的基因有望發(fā)現(xiàn)與精子發(fā)生相關(guān)的新基因，或發(fā)現(xiàn)已知基因的新功能，研究結(jié)果對(duì)于揭示人睪丸發(fā)育/精子發(fā)生的分子機(jī)制、建立男性不育在分子水平的診斷方法、發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生障礙的基因治療手段和尋找男性避孕的新方法均具有重要意義?；罨托盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白抑制蛋白（protein inhibitor of activated STAT, PIAS）家族屬于這類蛋白。目前，真核哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的PIAS家族成員主要包括PIAS1、PIAS2、PIAS3和PIASy[4-6]。PIAS蛋白家族在人睪丸組織中存在著多種調(diào)節(jié)機(jī)制，同時(shí)在睪丸功能中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[7]。

PIAS2包括PIASxα、PIASxβ和PIAS-NY 3個(gè)成員[1]。序列分析發(fā)現(xiàn)，PIAS-NY是PIASx的一個(gè)新的不同剪接體[7]。PIAS-NY mRNA在成人睪丸中高表達(dá)，在胚胎睪丸中低表達(dá)，而且成人睪丸中的表達(dá)水平是胚胎期的14倍；PIAS-NY mRNA特異表達(dá)于人睪丸及胰腺中，而在其他器官中未見表達(dá)[6]。提示PIAS-NY主要在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

PIAS-NY作為一種新發(fā)現(xiàn)的睪丸特異表達(dá)基因，同其他家族成員一樣，具有典型的N端的SAP結(jié)構(gòu)域、PINIT氨基酸基序及RLD結(jié)構(gòu)域。目前，PIAS-NY相關(guān)研究非常少，為了闡述其在精子發(fā)生過程中具體作用機(jī)制，本研究構(gòu)建PIAS-NY原核表達(dá)質(zhì)粒，通過誘導(dǎo)大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)融合蛋白，純化后獲得高純度的可溶性原核表達(dá)蛋白，多次免疫BalB/C小鼠并制備PIAS-NY多克隆抗體。本研究獲得PIAS-NY全長(zhǎng)開放閱讀框，包含PIAS-NY全部結(jié)構(gòu)域，有利于全面開展作用蛋白的深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

LA-Taq DNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司，小劑量質(zhì)粒抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠切膠純化試劑盒購(gòu)于北京BioTeke公司，T4連接酶及質(zhì)粒pET30a購(gòu)自美國(guó)Promega公司，限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，F(xiàn)reund完全佐劑和不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，His-Binding-Resin購(gòu)自上海悅克生物科技有限公司，透析袋購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司,改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco, DMEM）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，新生胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，兔抗鼠RUVBL2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋有限公司，RIPA裂解液購(gòu)自武漢博士德生物公司，免疫共沉淀試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司，超敏化學(xué)發(fā)光（Enhanced Chemiluminescence, ECL）試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。人精原cDNA文庫(kù)、GC2細(xì)胞和293T細(xì)胞均由揚(yáng)州大學(xué)鄭英教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 PIAS-NY擴(kuò)增引物根據(jù)Gen Bank基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，PIAS-NY基因正向引物5'-GGGGAATTCGGATGGCGGATTTCG AAGAGTTG-3'（劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)），反向引物5'-GGGCTCGAGTTACCCATCTAATATTAGA CTTTC-3'（劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn)）。50 μl PCR反應(yīng)體系：10×LA Tap Buffer 5 μl，dNTP（10 mmol/L）1 μl，Primer F 2 μl，Primer R 2 μl，模板 2 μl，高保真Taq酶0.5 μl，H2O 37.5 μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱5 min，95℃變性 30 s，58℃退火60 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃恒溫16 h。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，45 min，割膠回收PIAS-NY片段，大小為1 275 bp。

1.2.2 PIAS-NY-pET30a原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將0.5 μl PIAS-NY-pET30a質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37℃ LB/Kan+固體平板上培養(yǎng)過夜。次日，挑選單克隆菌落于10 ml LB液體/Kan+，225 r/min，37℃，過夜。用過夜菌液將250 ml LB液體/Kan+OD調(diào)至0.3左右，225 r/min，37℃ 3 h，測(cè)得光密度（optical density, OD）值為0.5左右，取出1 ml菌液作為空白對(duì)照，剩余菌液中加入終濃度1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG），兩者同時(shí) 225 r/min，37℃4 h，分別取出10 μl菌液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），確定BL21菌株是否表達(dá)融合蛋白。陽性菌液3 500 r/min，4℃ 20 min，去除上清液，置入-20℃冰箱冷凍保存。向沉淀中加入 15 ml Binding Buffer A[20 mmol/L Tris-Cl（pH 7.9），0.5 mol/L NaCl，10%甘油]重懸，冰上間斷超聲裂解菌體（功率25%、超聲5 s、間歇5 s，總工作時(shí)間600 s），3 500 r/min、4℃、10 min，分別收集上清液和沉淀，向沉淀中加入15 ml Binding Buffer B（破菌緩沖液B：破菌緩沖液A加入8 mol/L尿素），繼續(xù)超聲懸浮液（功率25%、超聲5 s、間歇5 s，總工作時(shí)間600 s），3 500 r/min、4℃、10 min，分別收集蛋白上清液和沉淀。SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，確定PIAS-NY-pET30a原核表達(dá)融合蛋白以哪種形式存在于大腸桿菌中。

1.2.3 透析袋預(yù)處理 將透析管裁剪成30 cm小段，將2%（m/V）碳酸氫鈉和1 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）（pH=8.0）溶液煮沸，透析袋浸泡其中煮沸10 min；用蒸餾水徹底漂洗；1 mmol/L EDTA（pH=8.0）溶液煮沸，透析袋浸泡煮沸10 min；室溫冷卻，蒸餾水徹底漂洗，4℃蒸餾水完全浸泡保存。整個(gè)過程全部帶手套操作，使用前必須仔細(xì)檢查，不漏方可使用。

1.2.4 融合蛋白純化及復(fù)性 用His-Binding-Resin對(duì)收集融合蛋白進(jìn)行純化，以下整個(gè)過程均在4℃完成。安裝好His-Ni柱，先用10 ml Binding Buffer B平衡去除穿透液體。將3 ml融合蛋白上清液加入純化柱中，收集穿透夜，以觀察吸附效果。加入蛋白樣品，滴完后用2.5 ml Binding Buffer B洗柱1遍，盡量去除非特異性吸附的雜蛋白。依次用2 ml Eluting buffer洗脫（破菌緩沖液B中加入不同終濃度咪唑，濃度依次為5、25、50、100及200 mmol/L），控制滴速2～3 ml/h，分段收集洗脫液。用5 ml Binding Buffer B過柱，將上述收集的咪唑洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。發(fā)現(xiàn)100和200 mmol/L洗脫液中含有較高濃度目的蛋白，將100和200 mmol/L洗脫液混合液裝入激活的透析袋中，4℃依次經(jīng)過7、6、5、4、3及2 mol/L尿素緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性，各梯度濃度分別復(fù)性24 h，最后收集蛋白液體。用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。以200 μl/管進(jìn)行蛋白分裝，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.5 免疫小鼠制備抗體 用苦味酸對(duì)20只20 g BalB/C小鼠進(jìn)行隨機(jī)標(biāo)記，從1連續(xù)到20，隨機(jī)挑選出3只作為陰性對(duì)照。取2管蛋白液體融化，分別加入等體積的Freund完全佐劑充分混合乳化后，按照100 μg/只蛋白劑量進(jìn)行BalB/C小鼠腹腔注射，對(duì)照組注射等體積1×PBS緩沖液和Freund完全佐劑。2周后，取2管蛋白液體加等體積Freund不完全佐劑充分混合，按100 μg/只小鼠BalB/C小鼠腹腔注射。每隔2周加強(qiáng)1次，共4次。2個(gè)月后，將免疫好的小鼠眼球取血，收集血清。分裝后作好標(biāo)記，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）抗血清滴度 將純化PIAS-NY蛋白用包被液稀釋至所需濃度5 μg/ml，96孔板中每孔加入100 μl，將96孔板放入濕盒，4℃過夜；次日，去除包被液，用PBS-T洗滌3次，5 min/次；加入含0.1%脫脂奶粉PBS-T，每孔150 μl，37℃封閉1 h；去除封閉液，PBS-T洗滌3次，5 min/次；按比例稀釋PIAS-NY抗血清（1∶100、1∶1 000、1∶104、1∶105及1∶106），每孔加入100 μl，同時(shí)以BalB/C小鼠血清為陰性對(duì)照，37℃孵育70 min；PBS-T洗滌3次，5 min/次；二抗孵育：山羊抗小鼠IgG（1∶1 000倍稀釋于PBS-T），每孔加入100 μl，37℃孵育60 min，PBS-T洗滌3次，5 min/次，加顯色液100 μl，室溫避光保存10 min，加入2滴終止液，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)（A490）。

1.2.7 免疫共沉淀 293T細(xì)胞鋪6孔板，4℃預(yù)冷PBS輕輕洗滌細(xì)胞表面3次，每孔加入Roche免疫共沉淀試劑盒中的lysis buffer1 80 μl，冰上5～10 min，用刮棒將每孔內(nèi)細(xì)胞裂解物刮干凈，吸出于一EP管中，冰上30 min（每5 min上下顛倒混勻1次）。4℃13 000 r/min 15 min。將上清吸至另一EP管中，置于冰上。取出60 μl上清液液，剩余蛋白液體平均分為2份，每份分別加入鼠IgG和PIAS-NY抗血清各8 μl（或者兔IgG和RUVBL2單克隆抗體各8 μl）。4℃冰箱，滾筒上2 h。取80 μl protein G小珠子于一EP管中，10 000 r/min 20 s棄上清液，加500 μl lysis buffer1，混勻，10 000 r/min，棄上清液。2 h后將2份蛋白上清分別加入含小珠子的EP管中，混勻。4℃滾筒上過夜。次日，上下翻轉(zhuǎn)，4℃ 10 000 r/min 20 s，棄上清。每管中加入500 μl lysis buffer 1洗滌珠子，上下翻轉(zhuǎn)，4℃10 000 r/min 10 s，棄上清液。1 ml的wash buffer 2洗滌珠子，上下翻轉(zhuǎn)，4℃10 000 r/min 10 s，棄上清液。1 ml的wash buffer 3洗滌珠子，上下翻轉(zhuǎn)，4℃ 10 000 r/min 10 s棄上清液。加35 μl的1×loading buffer，混勻，煮沸5 min，上下翻轉(zhuǎn)，4℃ 10 000 r/min 5 min收集上清液，即為興趣蛋白-目的蛋白混合物。SDS-PAGE電泳后分別用兔源RUVBL2抗體免疫印跡檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PIAS-NY-pET30a質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

1.5%瓊脂糖凝膠電泳得到5 388和1 275 bp片段（見圖1）。測(cè)序結(jié)果中插入片段序列與PIAS-NY基因開放閱讀框序列完全一致，因此原核表達(dá)載體PIASNY-pET30a已構(gòu)建成功。

2.2 PIAS-NY原核表達(dá)情況

與誘導(dǎo)前菌液和對(duì)照組比較，誘導(dǎo)后大腸桿菌中均存在一分子量約為43 kD且表達(dá)量相當(dāng)高的蛋白條帶。與融合蛋白His-PIAS-NY 45 kD大小十分接近，而且僅存在2個(gè)IPTG誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組中。因此提示PIAS-NY原核表達(dá)成功。見圖2。

圖1 PIAS-NY-pET30a重組質(zhì)粒電泳圖

2.3 His-PIAS-NY-His蛋白的純化及復(fù)性

His-PIAS-NY-His融合蛋白主要存在于沉淀中，即以包涵體形式存在于大腸桿菌BL21中。100 mmol/L咪唑洗脫液和200 mmol/L咪唑洗液脫液中含高純度蛋白。見圖3。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比所得抗體效價(jià)均達(dá)到1∶100 000。PIAS-NY抗血清能夠特異性識(shí)別GC2細(xì)胞和293T細(xì)胞中的PIAS-NY蛋白。見圖4。

2.5 免疫共沉淀檢測(cè)情況

293T細(xì)胞總蛋白中PIAS-NY抗血清沉淀出的復(fù)合物中存在RUVBL2蛋白，而且與293T細(xì)胞中的RUVBL2蛋白大小一致，然而BalB/C小鼠血清沉淀復(fù)合物中并未發(fā)現(xiàn)RUVBL2蛋白。結(jié)果顯示制備的多克隆抗體在分子水平對(duì)蛋白具有特異識(shí)別作用。見圖5。

圖2 誘導(dǎo)前后菌液SDS-PAGE電泳圖

圖3 His-PIAS-NY純化SDS-PAGE電泳圖

圖4 PIAS-NY多克隆抗體特異性

圖5 PIAS-NY多克隆抗體特異性

3 討論

抗體的制備技術(shù)經(jīng)歷很長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)展。包括多克隆抗體階段、單克隆抗體階段和基因工程抗體階段[8]。目前實(shí)驗(yàn)過程中使用的抗體多為市場(chǎng)化的單克隆抗體，但對(duì)一些效果不太理想或者市場(chǎng)上沒有的蛋白質(zhì)抗體，實(shí)驗(yàn)室制備多克隆抗體滿足一些實(shí)驗(yàn)需求。

PIAS蛋白家族最初是作為激活STAT轉(zhuǎn)錄活性的抑制蛋白被發(fā)現(xiàn)的[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PIAS蛋白可以與60多種蛋白作用參與多種細(xì)胞活動(dòng)[10]，涉及到胚胎發(fā)育、造血肝干細(xì)胞自我更新[11]、先天性和后天適應(yīng)性免疫反應(yīng)[12]、空間學(xué)習(xí)和長(zhǎng)期記憶等多個(gè)方面[13]。PIAS-NY基因是2004年新發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究報(bào)道非常少。之前的研究主要集中在細(xì)胞mRNA水平，而蛋白水平未見報(bào)道。因此，制備抗體是繼續(xù)深入開展蛋白水平研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)用到的全部分子生物學(xué)技術(shù)是研究生階段時(shí)鄭英教授課題組實(shí)驗(yàn)室的固有技術(shù)，現(xiàn)均已成熟掌握。原核蛋白表達(dá)、提取、純化和復(fù)性等一系列美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的實(shí)驗(yàn)原理和方法能深刻理解并能成熟運(yùn)用，之前所在實(shí)驗(yàn)室也已成功制備出人NYD-SP28多克隆抗體[14]和Setd8多克隆抗體[15]。

基于前期的工作，筆者制備PIAS-NY多克隆抗體。誘導(dǎo)的融合蛋白中包括了蛋白PIAS-NY全部氨基酸序列，并且氨基端和羧基端均存在His標(biāo)簽，大大提高融合蛋白和Ni柱的親和性，咪唑洗脫后獲得高濃度可溶性融合蛋白。經(jīng)過濃度梯度尿素稀釋復(fù)性后，筆者獲得具有一定空間構(gòu)像的PIAS-NY免疫原。純化蛋白經(jīng)過充分乳化后，6次腹腔注射BalB/C小鼠。雖然BalB/C小鼠廣泛用于免疫學(xué)、生理學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但由于小鼠本身存在免疫缺陷，因此在免疫過程中仍應(yīng)注意小鼠的健康狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)組共17只小鼠，最終只有13只小鼠存活，眼球取血。

ELISA檢測(cè)所有存活小鼠的血清效價(jià)均在1∶100 000以上；Western blot也證實(shí)抗血清能夠特異性識(shí)別293T細(xì)胞和GC2細(xì)胞的PIAS-NY蛋白；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明抗血清能夠識(shí)別并結(jié)合自然狀態(tài)下PIAS-NY蛋白，同時(shí)也提示真核哺乳細(xì)胞中PIAS-NY與RUVBL2存在相互作用。而RUVBL2是進(jìn)化上高度保守的AAA+家族的成員之一，在睪丸中高表達(dá)，具有ATP酶活性，與同源蛋白R(shí)UVBL1形成多聚物參與到不同的細(xì)胞活動(dòng)中[16-17]，如有絲分裂紡錘體的組裝[18-20]、端粒酶的形成[21]、染色體重塑等[22-25]，但是具體的分子機(jī)制并不清楚。通過質(zhì)譜對(duì)睪丸RNA結(jié)合蛋白組學(xué)進(jìn)行了分析，包括17種蛋白質(zhì)，在圓形精細(xì)胞中表達(dá)量均比長(zhǎng)形精子中高3倍，而RUVBL2是其中之一[26]。這也提示PIAS-NY和RUVBL2在精子發(fā)生中共同發(fā)揮重要作用。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)過程中已成功制備出PIAS-NY多克隆抗體，為下一步進(jìn)行蛋白的功能和機(jī)制研究打下了一定的基礎(chǔ)。