背根神經(jīng)節(jié)巨噬細胞遷移抑制因子參與調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的機制研究*

龍迎曦，唐軼珣，黃曉玲，潘冰冰，劉永平，魏來，孔高茵

[湖南省人民醫(yī)院（湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院） 麻醉科（湖南省圍術(shù)期加速康復(fù)麻醉臨床醫(yī)學(xué)研究中心），湖南 長沙410005]

神經(jīng)病理性疼痛困擾全世界約1.0～5.6億人，其病因復(fù)雜，疼痛程度嚴重，給患者帶來極大的痛苦[1-2]。因此，為深入研究神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的機制，學(xué)者們建立許多重復(fù)性好、臨床模擬度高的動物模型，其中最經(jīng)典的是慢性坐骨神經(jīng)壓迫（chronic constriction injury, CCI）模型?；趧游锬Ｐ秃团R床層面的研究提示，炎癥反應(yīng)、神經(jīng)受損后的異常放電、膠質(zhì)細胞的活化和中樞及外周的敏化是神經(jīng)病理性疼痛的主要機制[2-4]。其中，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛形成的重要機制[5]。當外周神經(jīng)受損時，背根神經(jīng)節(jié)上的炎癥反應(yīng)激活膠質(zhì)細胞，導(dǎo)致神經(jīng)細胞的敏化[5]。因此，以神經(jīng)受損后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)為靶向目標，給神經(jīng)病理性疼痛的治療帶來廣闊的前景。

巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）是第一個被發(fā)現(xiàn)在免疫性炎癥中發(fā)揮多效炎癥介質(zhì)功能的細胞因子，可由免疫細胞如巨噬細胞、B細胞以及非免疫細胞如內(nèi)皮細胞等合成，它主要通過抑制巨噬細胞游走，增強巨噬細胞的吞噬、內(nèi)殺傷等作用促進炎癥反應(yīng)[6]。本研究復(fù)制CCI模型，通過觀察鞘內(nèi)注射MIF拮抗劑ISO-1對CCI大鼠機械痛閾、脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion, DRG）MIF、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）表達變化、坐骨神經(jīng)電生理的影響，探討DRG中MIF參與調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的機制，從炎癥機制的角度為開發(fā)特異性高、鎮(zhèn)痛效果良好的新型藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10%水合氯醛（購自湖南省人民醫(yī)院），MIF拮抗體劑ISO-1（MIF拮抗劑）購自德國Calbiochem公司，TNF-α及IL-1β ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），小鼠單克隆Anti-MIF抗體和大鼠單克隆Anti-GAPDH抗體購自Santa Cruz公司，電子von Frey測痛儀（型號2390）購自美國IITC。

1.2 動物及分組

24只無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠，由湖南省人民醫(yī)院動物實驗中心代購，體重220～250 g，飼養(yǎng)于24℃室溫條件下，相對濕度50%～60%，自由攝食和飲水。隨機分為3組，每組8只：假手術(shù)組（Sham組）；CCI組（CCI術(shù)后，鞘內(nèi)連續(xù)注射溶劑——10%DMSO 10 μl 14 d）；ISO-1組（CCI術(shù)后，鞘內(nèi)連續(xù)注射含 ISO-1 30 μg的 10% DMSO 10 μl 14 d）。該實驗所有與動物飼養(yǎng)和操作都遵循國際動物保護協(xié)會和國際疼痛研究學(xué)會的相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批號：2016年009號）。

1.3 鞘內(nèi)置管

腹腔注射10%水合氯醛麻醉（劑量350 mg/kg）。刺激大鼠無體動后，置大鼠于俯臥位，通過髂棘定位于L3～L4間隙，去毛，使用絡(luò)合碘消毒，作長2～3 cm的縱切口，分離L4棘突兩側(cè)肌肉，切除L4棘突和鄰近椎板，定位L3與L4棘突間隙，置入25 G針，穿破黃韌帶及硬脊膜后，可見腦脊液溢出。經(jīng)破口處插入PE-10導(dǎo)管2 cm，18 G硬膜外穿刺針在大鼠皮下穿一隧道，導(dǎo)管的另一端送至頸背部，外露2～3 cm固定，外口封閉，防止腦脊液外溢。排除置管時癱瘓的大鼠（可能為脊髓受損所致，出現(xiàn)概率約為20%）。術(shù)后于傷口處涂抹金霉素軟膏，并于術(shù)后3 d肌內(nèi)注射青霉素1萬IU/d抗感染。置管后第3天，導(dǎo)管內(nèi)注射2%利多卡因20 μl。若出現(xiàn)下肢癱瘓，且30～40 min左右恢復(fù)，即提示鞘內(nèi)置管成功。每次注藥時，使用微量注射器（規(guī)格50 μl）給藥10 μl，注射時間為20 s，再用10μl生理鹽水沖管，確保藥液完全進入鞘內(nèi)。

1.4 CCI模型的復(fù)制

按照BENNET等人的方法制備大鼠左后肢CCI模型[7]，方法如下：大鼠鞘內(nèi)置管5 d后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（劑量350 mg/kg）。刺激大鼠無體動后，置大鼠于俯臥位，在左股骨外側(cè)切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用4-0鉻制羊腸線松結(jié)扎坐骨神經(jīng)干4道，每道間距為1 mm。小腿肌肉輕度顫動且不影響神經(jīng)外膜血運的結(jié)扎強度為最佳。術(shù)畢使用金霉素眼膏涂抹傷口，并使用青霉素肌內(nèi)注射1萬IU/d，抗感染3 d。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，加強營養(yǎng)。Sham組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不進行結(jié)扎。

1.5 機械痛閾測定

在術(shù)前1天，術(shù)后第1、3、5、7、10及14天（鞘內(nèi)給藥2 h后）測定各組大鼠機械痛閾值（術(shù)前1天，術(shù)后第1、3、5及7天測8只大鼠機械痛閾值；由于第7天每組處死4只大鼠取組織，因此術(shù)后第10和14天測余下4只大鼠機械痛閾值）：將大鼠放置于距實驗臺高30 cm的鐵絲網(wǎng)架上，大鼠適應(yīng)且處于安靜狀態(tài)后，用電子von Frey痛閾測定儀探頭接觸小鼠患側(cè)肢體足底中央，緩慢增加壓力直至肢體抬起。此時儀器的讀數(shù)為小鼠機械性縮足閾值。每只動物測5次，取平均值。

1.6 ELISA檢測脊髓背根神經(jīng)節(jié)炎癥因子TNF-α、IL-1β的濃度

于術(shù)后第7和14天，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，采用頸椎脫臼法，每組各處死大鼠4只，沿棘突切開皮膚，剪除棘突和椎板，快速取出取各組大鼠左側(cè)L4～6脊髓DRG，置于EP管中，置入-80℃冰箱冷凍保存。

檢測前將脊髓DRG取出，稱質(zhì)量，標本放入4℃、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，制成勻漿液，4℃下20 000 r/min離心30 min，取上清液（主要含有非膜結(jié)合TNF-α），置于4℃冰箱中保存；再用pH=7.4的PBS懸浮上述離心后的沉淀，4℃孵育1 h，然后4℃下20 000 r/min離心20 min，取上清液（主要含膜結(jié)合的TNF-α）。兩上清液之和即為各組織中的總TNF-α含量，混勻待測。采用ELISA試劑盒檢測TNF-α濃度，Bio-Rad酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A）值，根據(jù)標準曲線計算TNF-α相對濃度，結(jié)果以pg/mg表示。

檢測前將脊髓DRG取出，稱重量，然后將其置于4℃、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，制成勻漿液。使用玻璃勻漿器在4℃下勻漿，4 ℃下20 000 r/min離心30 min，取上清液。按照ELISA試劑盒提供的標準步驟測定IL-1β濃度，Bio-Rad酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A）值，根據(jù)標準曲線計算IL-1β相對濃度，結(jié)果以pg/mg表示。

1.7 Western blot檢測患肢側(cè)背根神經(jīng)節(jié)MIF的表達

于術(shù)后第7和14天，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，沿棘突切開皮膚除棘突和椎板，快速取出取各組大鼠左側(cè)L4～6脊髓DRG，取出已收集的脊髓DRG，加入組織裂解液，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。取50 μl蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入MIF抗體（1∶1 000稀釋）4℃下孵育過夜。重復(fù)清洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗工作液（羊抗兔1∶2 000），室溫下孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光顯色，采用Alpha Innotech光密度分析軟件，以GAPDH為內(nèi)參進行定量分析，每組重復(fù)檢測3次。圖像分析軟件定量分析靶蛋白及內(nèi)參GAPDH條帶含量，計算MIF/GAPDH比值，進行統(tǒng)計分析。

1.8 大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定

于術(shù)后第14天測定大鼠坐骨神經(jīng)的傳導(dǎo)速度（conduction velocity, CV）（n=4）。采用 BL-420E 生物機能實驗系統(tǒng)軟件（成都泰盟公司）肌肉神經(jīng)實驗中神經(jīng)干興奮傳導(dǎo)速度測定模塊，刺激并記錄動作電位。腹腔注射10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg）。刺激大鼠無體動后，置大鼠于俯臥位固定，切開皮膚，分離肌肉，充分暴露結(jié)扎段坐骨神經(jīng)。游離出坐骨神經(jīng)干，用兩絕緣電極分別勾于結(jié)扎坐骨神經(jīng)處的近端和遠端（兩絕緣電極距離為2 cm），其中刺激電極位于記錄電極的遠端。接地線連接的鉗夾夾住皮膚。確認接觸良好后，施加電刺激，找出誘發(fā)穩(wěn)定動作電位的最大刺激，記錄到穩(wěn)定的動作電位后，記錄潛伏期（兩電極之間的距離刺激偽跡出現(xiàn)至動作電位的起始部）。并計算出（CV）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，配對t檢驗，單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，方差分析的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ISO-1對CCI大鼠機械痛敏的影響

3組大鼠在術(shù)前1天的機械痛閾值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3組大鼠術(shù)后第1、3、5及7天的機械痛閾值，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的機械痛閾值有差異（F=22.843，P=0.000）；②3組大鼠機械痛閾值有差異（F=58.170，P=0.000）；③3組大鼠的機械痛閾值變化趨勢有差異（F=37.413，P=0.000）。見表1。3組大鼠術(shù)后第10和14天的機械痛閾值有差異（第7天：F=139.399，P=0.000；第14天：F=246.908，P=0.000）；與Sham組比較，CCI組大鼠機械痛閾值均降低（P＜0.05）；與CCI組比較，ISO-1組大鼠機械痛閾值均升高（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠各時間點機械痛閾值比較 （n =8，±s）

表1 各組大鼠各時間點機械痛閾值比較 （n =8，±s）

組別 術(shù)前1天 術(shù)后第1天 術(shù)后第3天 術(shù)后第5天 術(shù)后第7天Sham 組 13.65±1.66 13.26±1.39 12.81±1.54 14.13±1.92 13.60±1.87 CCI組 13.00±1.49 5.12±0.90 4.10±0.68 4.56±0.84 4.23±0.78 ISO-1 組 13.16±1.08 4.99±1.08 4.20±1.22 4.99±1.08 4.20±1.22

表2 各組大鼠術(shù)后第7和14天的機械痛閾值比較（n =4，±s）

表2 各組大鼠術(shù)后第7和14天的機械痛閾值比較（n =4，±s）

組別 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天Sham 組 13.26±1.39 12.81±1.54 CCI組 5.12±0.90 4.1±0.68 ISO-1組 10.85±1.33 10.45±1.24 F值 139.399 246.908 P值 0.000 0.000

2.2 ISO-1對CCI大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α表達的影響

第7和14天，3組大鼠IL-1β表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Sham組比較，在術(shù)后第7和14天，CCI組大鼠DRG中IL-1β表達均升高（P＜0.05）；與CCI組比較，術(shù)后第7和14天，ISO-1組大鼠DRG中IL-1β表達均下調(diào)（P＜0.05）；與Sham組比較，術(shù)后第7天，ISO-1組大鼠DRG處IL-1β表達增加（P＜0.05），術(shù)后第14天，ISO-1組大鼠DRG中IL-1β表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

第7和14天，3組大鼠TNF-α表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Sham組比較，在術(shù)后第7和14天，CCI組大鼠DRG中TNF-α表達升高（P＜0.05）；與CCI組比較，術(shù)后第7和14天，ISO-1組大鼠DRG中TNF-α表達下調(diào)（P＜0.05）。與Sham組比較，術(shù)后第7和14天，ISO-1組大鼠DRG中TNF-α表達增加（P＜0.05）。見表4。

表3 各組大鼠術(shù)后第7和14天的IL-1β表達（n =4，±s）

表3 各組大鼠術(shù)后第7和14天的IL-1β表達（n =4，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與CCI組比較，P ＜0.05

組別 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天Sham 組 6.28±0.72 6.18±0.97 CCI組 17.42±0.781） 15.62±0.651）ISO-1 組 9.0±0.581）2） 6.96±0.982）F值 345.619 177.345 P值 0.000 0.000

2.3 ISO-1對CCI大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)MIF表達的影響

術(shù)后第7和14天，3組大鼠MIF表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Sham組比較，術(shù)后第7和14天CCI組大鼠DRG中MIF表達均升高（P＜0.05）。與CCI組比較，ISO-1組大鼠術(shù)后第7和14天DRG中MIF表達均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Sham組比較，ISO-1組大鼠術(shù)后第7天DRG中MIF表達無變化（P＞0.05），第 14 天表達增加（P＜0.05）。見表5和圖1。

2.4 ISO-1對CCI大鼠坐骨神經(jīng)CV的影響

3組大鼠坐骨神經(jīng)CV的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7 481.400，P=0.000）；與Sham組比較，CCI大鼠坐骨神經(jīng)CV降低（P＜0.05），與CCI組比較，ISO-1組大鼠坐骨神經(jīng)CV差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

表4 各組大鼠術(shù)后第7、14天的TNF-α表達（n =4，±s）

表4 各組大鼠術(shù)后第7、14天的TNF-α表達（n =4，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與CCI組比較，P ＜0.05

組別 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天Sham 組 2.34±0.73 2.50±0.61 CCI組 8.08±0.741） 7.1±0.721）ISO-1 組 4.14±0.551）2） 3.98±0.591）2）F值 93.140 70.505 P值 0.000 0.000

表5 各組大鼠術(shù)后第7和14天的MIF表達（n =4，±s）

表5 各組大鼠術(shù)后第7和14天的MIF表達（n =4，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與CCI組比較，P ＜0.05

組別 術(shù)后第7天 術(shù)后第14天Sham 組 0.14±0.006 0.13±0.02 CCI組 0.80±0.011） 0.87±0.041）ISO-1 組 0.13±0.0052） 0.29±0.051）2）F值 7 481.400 320.773 P值 0.000 0.000

圖1 各組大鼠DRG中MIF的表達

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)CV比較

3 討論

本研究顯示，坐骨神經(jīng)損傷后，受損部位的動作電位的傳導(dǎo)速度減慢，患肢表現(xiàn)出機械痛覺過敏，同時相應(yīng)DRG中MIF及炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α表達上調(diào)。鞘內(nèi)注射ISO-1能減輕CCI大鼠患肢的機械痛覺過敏，下調(diào)患肢相應(yīng)的DRG中MIF、IL-1β及TNF-α的表達，但不能改善受損神經(jīng)的傳導(dǎo)速度。本結(jié)果揭示MIF通過上調(diào)DRG中炎癥反應(yīng)參與調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的形成。

MIF是一種多功能的促炎因子之一，與多種疾病相關(guān)[8]。神經(jīng)受損后中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的MIF表達改變提示其參與神經(jīng)元的變性和再生的調(diào)節(jié)[9]。DRG是外周痛覺信息傳入的第一級神經(jīng)元，組織損傷后，神經(jīng)膠質(zhì)細胞和施旺細胞被激活并釋放一系列炎癥細胞因子，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生；該細胞的激活也導(dǎo)致疼痛介質(zhì)的產(chǎn)生，降低動作電位的閾值，使膠質(zhì)細胞敏化，導(dǎo)致外周和中樞敏化，從而導(dǎo)致慢性神經(jīng)病理神經(jīng)痛形成[10]。筆者通過結(jié)扎大鼠左側(cè)的坐骨神經(jīng)復(fù)制CCI模型，行為學(xué)結(jié)果顯示，CCI術(shù)后，大鼠有穩(wěn)定的機械痛閾降低。蛋白印跡檢測證明同側(cè)DRG中MIF表達上調(diào)與CCI誘導(dǎo)的疼痛密切相關(guān)，且表現(xiàn)出時間依賴性。既往研究證實，在神經(jīng)病理性疼痛中，脊髓背角MIF表達也升高[11]。上述結(jié)果提示，MIF在脊髓背角和DRG 2個層面都與神經(jīng)病理性疼痛的形成相關(guān)。既往研究證實，ISO-1 30 μg能抑制炎性痛[12]，在筆者的前期實驗中，發(fā)現(xiàn)該劑量也能抑制CCI大鼠的機械痛敏。鞘內(nèi)注射ISO-1后，術(shù)后第1和3天實驗動物的機械痛閾并未增加，提示此劑量的ISO-1的鎮(zhèn)痛效應(yīng)出現(xiàn)在觀察期的中晚期。既往研究證實，在炎癥或神經(jīng)病理性疼痛模型中，脊髓背角小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元可能是炎性和神經(jīng)病性情況下MIF表達上調(diào)的主要來源[11]。然而，在背根神經(jīng)節(jié)中，是否存在者不同細胞的表達差異，有待進一步探究。

炎癥細胞因子導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展中越來越受到關(guān)注。其中在背根神經(jīng)節(jié)層面，促炎因子IL-1β和TNF-α與神經(jīng)病理性疼痛關(guān)系的研究較多。IL-1β可通過作用于辣椒素受體和IL-1R受體作用于p38 MAPK通路誘發(fā)疼痛[13]；TNF-α通過激活p38 MAPK通路促進Na+內(nèi)流，降低興奮性閾值，還可與受體結(jié)合后激活細胞NF-κB，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進疼痛的產(chǎn)生[14]。而作為重要的促炎因子，MIF可通過cPLA2-COX2通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞中其他炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6的表達[14]。本實驗中，鞘內(nèi)注射ISO-1可抑制DRG中TNF-α、IL-1β的表達。因此，MIF可能是促使疼痛形成的神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)中的上游介質(zhì)。

神經(jīng)電生理指標是評估神經(jīng)受損、功能狀態(tài)最客觀的指標。其中，神經(jīng)CV是神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的直接表現(xiàn)。在本實驗中，使用神經(jīng)電生理技術(shù)測量實驗動物受損坐骨神經(jīng)的動作電位傳導(dǎo)速度，結(jié)果顯示，與CCI組比較，ISO-1組的坐骨神經(jīng)CV并未改善。筆者推測，鞘內(nèi)注射ISO-1通過抑制脊髓和DRG中MIF的促炎作用，從而減輕CCI模型大鼠的機械痛敏，但并不能修復(fù)受損的坐骨神經(jīng)。但在受損神經(jīng)局部使用ISO-1處理是否能改善坐骨神經(jīng)的功能，將在進一步的實驗中探索。

本研究存在以下不足：首先，DRG中不同細胞對神經(jīng)病理性疼痛的貢獻不一，該研究并未從細胞層面去探究相關(guān)細胞的活化狀態(tài)與MIF的表達關(guān)系。其次，在該研究中，鞘內(nèi)注射ISO-1并未完全緩解CCI大鼠的疼痛，有可能與ISO-1的劑量相關(guān)，也可能與存在其他的機制參與CCI大鼠的痛覺形成有關(guān)。因此，在下一階段的研究中，筆者將從上述的不足著手，對背根神經(jīng)節(jié)MIF參與調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的機制進行更深一步的研究。

綜上所述，MIF可能通過上調(diào)炎癥細胞因子的表達參與神經(jīng)病理性疼痛的形成。因此，從炎癥角度，針對MIF拮抗劑的研究將為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供新視角。