張文明, 邱慧珍, 張春紅, 海 龍
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不同連作年限馬鈴薯根系分泌物的成分鑒定及其生物效應*
張文明, 邱慧珍, 張春紅, 海 龍
(甘肅農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室 蘭州 730070)
為探討馬鈴薯連作障礙的可能機理, 在大田條件下, 收集連作1~5 a(CP1-CP5)馬鈴薯植株的根系分泌物, 采用GC-MS對根系分泌物的主要成分進行了鑒定, 并通過生物檢測驗證了根系分泌物的生物效應。結果表明: CP1-CP5鑒定出的物質(zhì)主要有酸類、糖類、胺類、醇類、酯類和嘧啶類, 但各類物質(zhì)的數(shù)量和含量不同。CP1-CP5中均鑒定出棕櫚酸, 相對含量分別為0.55%、0.87%、1.24%、1.05%和0.95%, 濃度分別為7.12 mg×L-1、7.39 mg×L-1、9.46 mg×L-1、8.38 mg×L-1和8.02 mg×L-1。馬鈴薯根系分泌物顯著抑制了馬鈴薯的生長, 抑制作用隨連作年限延長而增強。棕櫚酸對馬鈴薯生長的抑制表現(xiàn)出明顯的濃度效應, 隨濃度升高而增強。馬鈴薯根系分泌物明顯促進了立枯絲核菌的生長, 菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量表現(xiàn)為CP3最高, CP1最低, CP2、CP4和CP5之間沒有顯著差異。棕櫚酸明顯促進了立枯絲核菌的生長, 隨著棕櫚酸濃度的增加, 菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量先增加再減小, 10 mg×L-1棕櫚酸的菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量最大。由此說明, 隨馬鈴薯連作年限延長, 根系分泌物的毒性越強; 馬鈴薯根系分泌物對立枯絲核菌的促進作用加劇了馬鈴薯的連作障礙, 棕櫚酸是馬鈴薯根系分泌的化感自毒物質(zhì)。
馬鈴薯; 連作年限; 根系分泌物; 成分鑒定; 棕櫚酸; 立枯絲核菌
馬鈴薯()是世界公認的全價食品, 是位居小麥()、玉米()和水稻()之后的世界第四大糧食作物[1], 是甘肅省第三大糧食作物。甘肅省是我國重要的馬鈴薯種薯和商品薯基地以及淀粉加工基地[2-3]。馬鈴薯產(chǎn)業(yè)是甘肅省促進農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的戰(zhàn)略性主導產(chǎn)業(yè), 極大地推動了甘肅省農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展。馬鈴薯是茄科(Solanaceae)作物, 不抗連作, 應避免重茬和迎茬種植[4]。然而, 隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展、種植效益的不斷提高和土地面積的限制, 馬鈴薯連作現(xiàn)象極其普遍, 連作障礙問題日趨嚴重, 產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降, 嚴重阻礙了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康、高效和可持續(xù)發(fā)展。
根系分泌物密切影響著植物的連作障礙, 而根系分泌物及其生物效應的研究已成為連作障礙的研究熱點[5-6]。根系分泌物是植物與土壤進行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體物質(zhì), 是植物響應外界脅迫的重要途徑, 是構成植物不同根際微生態(tài)特征的關鍵因素, 也是根際對話的主要調(diào)控者[7]。有關馬鈴薯根系分泌物筆者從收集方法、收集時期和自毒效應等方面進行了前期研究[8-9]。然而, 根系分泌物除了與植物種類、生育期有關外, 也與植物的生長環(huán)境密切相關[10], 并且根系分泌物的生物效應具有明顯的濃度效應[11]。目前, 有關馬鈴薯不同連作年限根系分泌物成分的動態(tài)變化的研究還較少。而馬鈴薯由于其特殊的生理特點和較大的株間差異, 嚴重影響了其根系分泌物研究工作的精確性和重現(xiàn)性。我們在前期研究工作中發(fā)現(xiàn), 馬鈴薯在當?shù)剡B作3年后產(chǎn)量開始顯著降低[12]。因此, 本研究對連作1~5 a的馬鈴薯根系分泌物進行了收集和成分鑒定, 對馬鈴薯根系分泌物中具有自毒作用的棕櫚酸進行了定量, 并就根系分泌物和不同濃度棕櫚酸對馬鈴薯幼苗和馬鈴薯立枯絲核菌()的生長進行了驗證, 旨在揭示馬鈴薯連作3 a以后產(chǎn)量下降的原因, 并進一步探索馬鈴薯連作障礙的形成機理, 為連作障礙的減緩和克服提供理論依據(jù)。
從2004年在甘肅省景泰縣條山農(nóng)場設置的馬鈴薯不同連作年限的長期定位試驗中, 于2014年選擇連作5 a、4 a、3 a、2 a和輪作(前茬為玉米)的試驗地塊, 分別記作CP5、CP4、CP3、CP2和CP1。每塊試驗地選3個點, 在馬鈴薯現(xiàn)蕾期每點分別挖取馬鈴薯植株5株, 抖干凈根系表面土壤, 將每點植株混合, 帶回實驗室, 分別用500 mL分析純甲醇反復淋洗根系, 將得到的根系分泌物4 000 r·min?1離心5 min, 然后將根系分泌物的甲醇溶液在35 ℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓蒸發(fā)到100 mL, 備用。
取5 mL制備好的根系分泌液, 用氮吹儀在35 ℃下吹干, 干后的殘渣進行硅烷衍生化。硅烷化過程如下: 加入0.5 mL Regisil試劑[99%N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+1%三甲基-氯硅烷]和l.16 mL嘧啶, 在70 ℃水浴中加熱30 min, 冷卻后用0.22 μm膜過濾, 濾液用來進行GC-MS分析。從硅烷化到分析過程在6 h內(nèi)完成。
氣相色譜和質(zhì)譜型號分別為6890N GC system和5973 Mass selective, 色譜柱型號為OV1701(50 m × 0.25 mm I.D. × 0.33 um), 載氣為氦氣, 流速為1 mL·min-1, 進樣體積為1 μL, 溫度梯度為85 ℃到220 ℃并以5 ℃·min-1上升, 無分流進樣; 掃描范圍為30~550 amu (M/Z), 轟擊電壓為70 ev, 掃描時間為0.2 s全掃描。應用標準圖庫(NIST98 & WILEY)通過計算機檢索系統(tǒng)進行物質(zhì)的鑒定。
棕櫚酸的自毒作用在馬鈴薯上已證實。配置棕櫚酸的10 mg×L-1、20 mg×L-1、50 mg×L-1、100 mg×L-1和200 mg×L-1的吡啶溶液, 通過峰面積和濃度關系建立標準曲線, 根據(jù)GC-MS不同連作年限根系分泌物中棕櫚酸的峰面積, 計算根系分泌物中棕櫚酸的濃度, 再根據(jù)根系分泌物中棕櫚酸濃度計算馬鈴薯植株的棕櫚酸分泌量。
棕櫚酸分泌量(mg×株-1)=棕櫚酸濃度×0.001×
1.66×50/5 (1)
通過生物檢測驗證馬鈴薯根系分泌物對馬鈴薯幼苗生長的影響。分別以不同連作年限馬鈴薯根系分泌物原液和棕櫚酸作為檢測對象。
1.5.1 根系分泌物原液的自毒效應
將1.1收集到的不同連作年限馬鈴薯根系分泌物用細菌過濾器過濾, 在培養(yǎng)皿中進行生物檢測試驗。培養(yǎng)皿(90 mm)底部先鋪兩層濾紙, 然后在每個培養(yǎng)皿中點播1粒馬鈴薯原原種種薯(品種為‘大西洋’), 在人工氣候箱中培養(yǎng)(白天溫度22 ℃, 濕度50%; 晚間溫度18 ℃, 濕度70%)。以甲醇為對照(CK), 共6個處理, 分別記作CK、CP1、CP2、CP3、CP4和CP5, 每處理重復10次, 每天澆水保持濾紙濕潤。在培養(yǎng)的第1 d、10 d和20 d分別向各培養(yǎng)皿中添加根系分泌物, 每次每培養(yǎng)皿加2 mL。培養(yǎng)30 d后測定植株莖粗、株高、地上部和地下部鮮重, 并計算化感效應指數(shù)(response index, RI)和綜合化感指數(shù)(synthetical effect, SE)。化感效應指數(shù)(RI)采用Williamson等[13]的方法進行, 當>時, RI=1?/; 當<時, RI=/?1。其中:為對照值,為處理值; RI>0為促進作用, RI<0為抑制作用, 絕對值大小與作用強度一致。SE為測試指標的RI平均值。
1.5.2 根系分泌物中棕櫚酸的生物毒性
棕櫚酸購自上?;瘜W試劑公司, 測定棕櫚酸對馬鈴薯生長的影響。分別配置5 mg×L-1、10 mg×L-1、50 mg×L-1和100 mg×L-1棕櫚酸的甲醇溶液, 以甲醇為對照(CK), 共5個處理, 分別用CK、P5、P10、P50和P100表示。其他同1.5.1。
1.6.1 根系分泌物原液對立枯絲核菌菌絲生長的影響
制備PDA培養(yǎng)基, 將1.1收集到的不同連作年限馬鈴薯根系分泌物用細菌過濾器過濾, 于超凈工作臺上取200 μL涂布在PDA培養(yǎng)基平板上, 靜置2 min, 使根系分泌物滲入培養(yǎng)基中, 以甲醇為對照(CK), 共6個處理, 分別記作CK、CP1、CP2、CP3、CP4和CP5, 每處理10次重復。采用菌餅接種法, 用直徑為0.5 cm的打孔器沿已生長繁殖好的新鮮供試立枯絲核菌菌落邊緣打下菌餅, 分別接種到上述培養(yǎng)基平皿中心, 每皿接種1個菌餅, 于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng), 分別在培養(yǎng)48 h、72 h和96 h后測定菌落直徑, 并在96 h后刮取菌絲測其鮮質(zhì)量, 按照1.5.1的方法計算響應指數(shù)(RI)和綜合化感指數(shù)(SE)。
1.6.2 不同濃度棕櫚酸對立枯絲核菌菌絲生長的影響
分別配置10 mg×L-1、20 mg×L-1、50 mg×L-1和100 mg×L-1棕櫚酸的甲醇溶液, 以甲醇為對照(CK), 共5個處理, 分別用CK、P5、P10、P50和P100表示。其他同1.6.1。
不同連作年限馬鈴薯根系分泌物總離子質(zhì)譜見圖1。不同連作年限馬鈴薯根系分泌物的總離子質(zhì)譜圖比較相似, 但峰面積大小不同。對圖1中的總離子質(zhì)譜圖通過計算機檢索系統(tǒng)鑒定, 按照相似度大于75%、峰面積大于500 000, 得到不同連作年限馬鈴薯根系分泌物的主要物質(zhì)(表1)。
從CP1、CP2、CP3、CP4和CP5馬鈴薯根系分泌物中分別鑒定出38種、31種、37種、32種和35種化合物,各處理根系分泌物中以有機酸類物質(zhì)種類最多, 略多于糖類物質(zhì); 以CP3分泌的有機酸類物質(zhì)相對豐度最大。在鑒定出的眾多化合物中, 棕櫚酸是已被證實的馬鈴薯的化感(自毒)物質(zhì)[8-9], 從CP1、CP2、CP3、CP4和CP5馬鈴薯根系分泌物中鑒定到的棕櫚酸相對含量分別為0.55%、0.87%、1.24%、1.05%和0.95%。
根據(jù)不同濃度棕櫚酸GC-MS圖中峰面積和濃度的關系, 建立棕櫚酸標準曲線圖。根據(jù)棕櫚酸標準曲線圖, 依據(jù)不同連作年限根系分泌物中棕櫚酸的峰面積, 計算出不同連作年限馬鈴薯根系分泌物中棕櫚酸的濃度和植株分泌量(表2)。
由表2可以看出, 連作1~5 a馬鈴薯根系分泌的棕櫚酸濃度呈先增加后減小的趨勢。CP3的根系分泌物中棕櫚酸濃度最高, 顯著高于其他連作年限。CP4和CP5根系分泌物中棕櫚酸濃度比CP3低, 但顯著高于CP1和CP2。這是由于CP4和CP5的植株生物量減小, 導致根系分泌物量減少, 從而根系分泌物中棕櫚酸的含量低于CP3。CP1和CP2馬鈴薯根系可以分泌棕櫚酸0.12 mg×株-1; 而CP3馬鈴薯根系分泌0.16 mg×株-1, 增加33.3%; CP4和CP5根系分泌的棕櫚酸比CP1分別增加16.7%和8.3%。
圖1 不同連作年限馬鈴薯根系分泌物總離子質(zhì)譜圖
CP1、CP2、CP3、CP4、CP5分別代表連作1~5 a的馬鈴薯根系分泌物。CP1, CP2, CP3, CP4and CP5indicate root exudates of potato continuously cropped for 1 to 5 years, respectively.
2.3.1 根系分泌物原液的自毒效應
由表3可以看出, 相對于對照, 馬鈴薯根系分泌物顯著抑制了馬鈴薯幼苗的株高、地上部和地下部鮮重, 且隨連作年限的延長抑制作用呈越大的趨勢。各指標化感指數(shù)和綜合化感指數(shù)都表現(xiàn)為隨連作年限延長而指數(shù)變大。
2.3.2 不同濃度棕櫚酸對馬鈴薯生長的影響
由表4可以看出, 不同濃度的棕櫚酸顯著抑制了馬鈴薯的株高、地上部鮮重和地下部鮮重, 化感指數(shù)都達到70%以上, 且有濃度越大抑制作用越大的趨勢。相對于對照, 5 mg×L-1、10 mg×L-1、50 mg×L-1和100 mg×L-1棕櫚酸的綜合化感指數(shù)分別達56.0%、68.4%、72.7%和76.9%。
2.4.1 根系分泌物原液對立枯絲核菌生長的影響
由表5可以看出, 相對于對照, 不同連作年限馬鈴薯根系分泌物明顯促進了立枯絲核菌的生長, 表現(xiàn)為48 h、72 h和96 h的菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量明顯增加, 且有隨著連作年限延長菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量先增加再減小的趨勢, 以CP3馬鈴薯根系分泌物的菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量最大, 顯著高于對照和其他連作年限。
2.4.2 不同濃度棕櫚酸對立枯絲核菌生長的影響
相對于對照, 棕櫚酸明顯促進了立枯絲核菌的生長, 表現(xiàn)為48 h、72 h和96 h的菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量明顯增加, 且有隨著棕櫚酸濃度的增加菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量先增加再減小的趨勢, 10 mg×L-1棕櫚酸的菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量最大(表6)。
目前, 對于不同連作年限馬鈴薯根系分泌物的動態(tài)變化研究還較少。從本試驗可以看出, 不同連作年限馬鈴薯根系分泌物中鑒定出的物質(zhì)主要有有機酸類、糖類、胺類、醇、酯和嘧啶類, 但各類物質(zhì)的數(shù)量和相對含量不同。輪作、連作2年、連作3年、連作4年和連作5年馬鈴薯根系分泌物中棕櫚酸的相對含量和濃度表現(xiàn)為先升高后降低, 以連作3年根系分泌物中相對含量和濃度最大, 連作4年和連作5年根系分泌物中棕櫚酸的相對含量和濃度明顯下降, 但顯著高于輪作根系分泌物中棕櫚酸的相對含量和濃度。這與李光等[14]等在高粱()上的研究結果相一致。由此表明, 連作改變了馬鈴薯根系分泌物。
表1 不同連作年限馬鈴薯根系分泌物的物質(zhì)成分
CP1、CP2、CP3、CP4、CP5分別代表連作1~5 a的馬鈴薯根系分泌物?!啊贝砦礄z出。CP1, CP2, CP3, CP4and CP5indicate root exudates of potato continuously cropped for 1 to 5 years, respectively. “—” stands for not detected.
表2 不同連作年限馬鈴薯根系分泌的棕櫚酸量
CP1、CP2、CP3、CP4、CP5分別代表連作1~5 a的馬鈴薯根系分泌物。同列不同小寫字母表示不同處理在0.05水平差異顯著。CP1, CP2, CP3, CP4and CP5indicate root exudates of potato continuously cropped for 1 to 5 years, respectively. Different letters in the same column indicate significant differences among treatments at 0.05 level.
馬鈴薯根系分泌物顯著抑制了馬鈴薯自身的生長, 且隨連作年限的延長馬鈴薯根系分泌物的抑制作用越大, 這與劉蘋等[15]在花生()上的研究結果一致; 也與大田中不同連作年限馬鈴薯的生長和產(chǎn)量結果相一致[12]。不同濃度棕櫚酸明顯降低了馬鈴薯的株高、地上部鮮重和地下部鮮重, 并有棕櫚酸濃度越高抑制作用越明顯的趨勢。由此表明, 馬鈴薯根系分泌物對馬鈴薯生長的抑制作用跟棕櫚酸有關。
表3 不同連作年限馬鈴薯根系分泌物原液對馬鈴薯幼苗生長的影響
CP1、CP2、CP3、CP4、CP5分別代表連作1~5 a的馬鈴薯根系分泌物?!啊贝砦礄z出。同列不同小寫字母表示不同處理在0.05水平差異顯著。CP1, CP2, CP3, CP4and CP5indicate root exudates of potato continuously cropped for 1 to 5 years, respectively. “—” stands for not detected. Different letters in the same column indicate significant differences among treatments at 0.05 level.
表4 不同濃度棕櫚酸對馬鈴薯幼苗生長的影響
同列不同小寫字母表示不同棕櫚酸濃度在0.05水平差異顯著。Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different contents of palmitic acid at 0.05 level.
根系分泌物是土壤與根際微生物相互作用的紐帶, 為根際微生物的生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)和能量, 同時也影響微生物的數(shù)量和種群結構[16]。已有研究結果表明, 有些根系分泌物對土傳病原菌繁殖或孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用[17], 有些對病原菌菌絲的生長和孢子萌發(fā)具有促進作用[18], 且任何化感物質(zhì)對病原菌的作用都與其濃度有關[19]。本研究結果表明, 馬鈴薯根系分泌物明顯促進了立枯絲核菌的生長, 且有隨著連作年限延長菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量呈先增加再減小的趨勢, 以連作3年馬鈴薯根系分泌物的菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量最大, 這與不同連作年限馬鈴薯根系分泌物中棕櫚酸的相對含量結果一致, 也可以揭示連作3年后馬鈴薯產(chǎn)量大量下降的原因。不同濃度棕櫚酸對立枯絲核菌生長的影響結果表明, 隨著棕櫚酸濃度的增加菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量呈先增加再減小的趨勢, 10 mg×L-1棕櫚酸的菌落直徑和菌絲鮮質(zhì)量最大。由此可見, 馬鈴薯根系分泌物能夠促進立枯絲核菌的生長, 且這種促進作用與根系分泌物中棕櫚酸有關。
表5 不同連作年限馬鈴薯根系分泌物對立枯絲核菌菌絲生長的影響
CP1、CP2、CP3、CP4、CP5分別代表連作1~5 a的馬鈴薯根系分泌物。同列不同小寫字母表示不同處理在0.05水平差異顯著。CP1, CP2, CP3, CP4and CP5indicate root exudates of potato continuously cropped for 1 to 5 years, respectively. Different letters in the same column indicate significant differences among treatments at 0.05 level.
表6 不同濃度棕櫚酸對立枯絲核菌菌絲生長的影響
同列不同小寫字母表示不同棕櫚酸濃度在0.05水平差異顯著。Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among different contents of palmitic acid at 0.05 level.
綜上所述, 隨馬鈴薯連作年限延長, 根系分泌物的毒性越強; 馬鈴薯根系分泌物對立枯絲核菌的促進作用加劇了馬鈴薯的連作障礙。
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Identification of chemicals in potato root exudates under different years of continuous cropping and their biologic effects*
ZHANG Wenming, QIU Huizhen, ZHANG Chunhong, HAI Long
(College of Resources and Environmental Sciences, Gansu Agricultural University / Gansu Province Key Laboratory of Arid Land Crop Science, Lanzhou 730070, China)
In order to explore possible obstruction mechanisms in continuous potato cropping systems, potato root exudates were collected in 1–5 years (CP1-CP5) continuous cropping systems of potato under field conditions. Chemical composition of root exudates was determined by the GC-MS method and biological effects of the exudates were detected by biological monitoring. The results showed that the main components of potato root exudates in CP1-CP5treatments included organic acids, glucides, amines, alcohols, esters and pyrimidines, although the chemicals occurred in different quantities and contents. Palmitic acid occurred in all the CP1-CP5systems, with relative contents of 0.55%, 0.87%, 1.24%, 1.05% and 0.95%, and concentrations of 7.12 mg×L-1, 7.39 mg×L-1, 9.46 mg×L-1, 8.38 mg×L-1and 8.02 mg×L-1, respectively. Biological analyses showed that potato root exudates significantly inhibited potato growth, with inhibition expression of CP5> CP4> CP3> CP2> CP1. The inhibition of potato growth by palmitic acid had obvious concentration effects, with inhibition expression of 100 mg×L-1> 50 mg×L-1> 10 mg×L-1> 5 mg×L-1. Potato root exudates obviously promoted the growth ofThe colony diameter and mycelia fresh weight ofwere highest in CP3and lowest in CP1. No significant differences were observed between CP2, CP4and CP5. Palmitic acid promoted the growth of. The colony diameter and mycelia fresh weight ofincreased firstly and then later decreased along with increasing concentration of palmitic acid. Colony diameter and mycelia fresh weight ofwere highest at 10 mg×L-1. The study showed that potato root exudates significantly inhibited potato growth, and the inhibiting effect increased with increasing number of years of continuous cropping. The promotion of potato root exudates togrowth exacerbated the obstacles of continuous cropping. Palmitic acid is the allelochemicals secreted by potato roots.
Potato; Continuous cropping years; Root exudate; Chemical composition identification; Palmitic acid;
ZHANG Wenming, E-mail: zhangwm@gsau.edu.cn
Jan. 17, 2018;
Apr. 13, 2018
S532; S181
A
1671-3990(2018)12-1811-08
10.13930/j.cnki.cjea.180086
2018-01-17
2018-04-13
* 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(201103004)、甘肅省青年基金項目(145RJYA283)、甘肅省科技支撐計劃項目(1011NKCA070)、甘肅省科技重大專項(1102NKDA025)和國家科技支撐計劃項目(2012BAD06B03)資助
* The study was supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of China (201103004), the Youth Fund of Gansu Province (145RJYA283), the Key Technology Research and Development Program of Gansu Province (1011NKCA070), the Key Science and Technology Project of Gansu Province (1102NKDA025) and the National Key Technology R&D Program of China (2012BAD06B03).
張文明, 主要從事植物營養(yǎng)與營養(yǎng)生態(tài)的研究。E-mail: zhangwm@gsau.edu.cn
張文明, 邱慧珍, 張春紅, 海龍. 不同連作年限馬鈴薯根系分泌物的成分鑒定及其生物效應[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報, 2018, 26(12): 1811-1818
ZHANG W M, QIU H Z, ZHANG C H, HAI L.Identification of chemicals in potato root exudates under different years of continuous cropping and their biologic effects[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2018, 26(12): 1811-1818