白菜型冬油菜RuBisCo蛋白亞基基因rbcL和rbcS的克隆及其在干旱脅迫下的表達(dá)

米 超 趙艷寧 劉自剛 陳其鮮 孫萬倉(cāng) 方 彥 李學(xué)才 武軍艷

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白菜型冬油菜RuBisCo蛋白亞基基因和的克隆及其在干旱脅迫下的表達(dá)

米 超2,**趙艷寧2,**劉自剛1,2,*陳其鮮3,*孫萬倉(cāng)1,2方 彥1李學(xué)才1,2武軍艷1,2

1甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心 / 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 甘肅蘭州 730070;2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 甘肅蘭州 730070;3甘肅省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站, 甘肅蘭州 730040

應(yīng)用雙向電泳結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)分析, 篩選得到干旱脅迫下白菜型冬油菜與光合作用相關(guān)差異蛋白質(zhì)RuBisCo小亞基。根據(jù)已發(fā)表白菜型油菜() RuBisCo亞基和保守序列設(shè)計(jì)引物, 采用RT-PCR擴(kuò)增隴油7號(hào)的cDNA, 獲得和基因開放閱讀框, 長(zhǎng)度分別為1095 bp和549 bp, 編碼364和181個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示, rbcL與大白菜(subsp.)的蛋白質(zhì)同源性達(dá)到99%以上, 其保守序列屬于RuBisCo Large超家族, 該蛋白質(zhì)理論相對(duì)分子量及等電點(diǎn)分別為40.29 kDa和6.70, 不穩(wěn)定指數(shù)(instability index, II>40為不穩(wěn)定蛋白質(zhì))為41.67, 屬于不穩(wěn)定蛋白; 脂融指數(shù)(aliphatic index)為83.63, 平均親水性值(grand average of hydropathicity)為-0.232, 屬于親水性蛋白質(zhì); 二級(jí)結(jié)構(gòu)包括38.74% α-螺旋(alpha helix)、10.99%延伸鏈(extended strand)及50.27%自由卷曲(random coil); 三級(jí)結(jié)構(gòu)具有5個(gè)不同的活性口袋。rbcS與甘藍(lán)()蛋白質(zhì)同源性達(dá)到99%, 其保守序列具有rbcS超家族和RuBisCo Small Like超家族, 理論相對(duì)分子量為20.32 kDa, 理論等電點(diǎn)為8.23, 不穩(wěn)定指數(shù)為33.66, 屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì); 脂融指數(shù)為74.86, 平均親水性值為-0.142, 屬于親水性蛋白質(zhì); 二級(jí)結(jié)構(gòu)包括16.02% α-螺旋、28.73%的延伸鏈及55.25%自由卷曲; 三級(jí)結(jié)構(gòu)具有4個(gè)不同的活性口袋。實(shí)時(shí)熒光定量和半定量分析顯示, 干旱脅迫下, 白菜型冬油菜葉片和基因表達(dá)量下調(diào)是光合作用下降的原因。并且, 冬油菜葉片n下降與RuBPCase表達(dá)抑制和活性降低有關(guān), 非氣孔限制是下降的主要因素。

白菜型冬油菜;;; 干旱脅迫

干旱是農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的主要影響因子。隨著全球氣溫的上升, 水資源匱乏加劇, 世界范圍內(nèi)將面臨持續(xù)干旱, 干旱將成為世界范圍農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要限制因素。我國(guó)西北地區(qū)屬于干旱、半干旱地區(qū), 年降水量較少、降水分布不均, 干旱嚴(yán)重制約著該地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展。

蛋白質(zhì)組(Proteome)是生物個(gè)體、某一組織或細(xì)胞在特定時(shí)空表達(dá)的全部蛋白質(zhì), 蛋白質(zhì)組學(xué)分析生物體內(nèi)、組織或者細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)成分、表達(dá)水平及修飾情況, 從而了解蛋白質(zhì)間的相互作用, 以此研究蛋白質(zhì)水平上對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制。干旱脅迫下, 白菜型冬油菜的存活率依賴于其避旱或耐旱能力, 其中, 光合作用是重要的代謝過程[1]。植物感知干旱脅迫后, 通常表現(xiàn)出氣孔關(guān)閉、光系統(tǒng)損傷、氣孔限制以及光合作用關(guān)鍵酶的含量及活性變化。高等植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)由8個(gè)大亞基(rbcL)和8個(gè)小亞基(rbcS)組成, 是光合作用中決定碳同化速率的關(guān)鍵酶。干旱脅迫下, 植物RuBisCo活性及含量均下降, 并且, 抗旱性強(qiáng)的材料下降程度小于敏感材料[2], 因此, 抗旱材料在干旱條件下光合作用維持在較高的水平。擬南芥遭受逆境脅迫時(shí), RuBisCo大亞基發(fā)生解聚的同時(shí), 與之相互作用的蛋白質(zhì)及結(jié)合量也發(fā)生了變化。Jeroni等[2]、Massacci等[3]、Flexas等[4]研究顯示, 中度干旱脅迫造成光合作用相關(guān)酶RuBisCO、PEPase等活性及含量下降。研究顯示, 菠菜中表達(dá)水平受到調(diào)控[5]。從甘薯[6]、大豆[7]、青稞[8]、菊花[9-10]等植物中已分離克隆了和基因。白菜型油菜()是蕓薹屬的栽培油料作物之一, 具有耐遲播、生育期短、耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)等突出優(yōu)點(diǎn), 也是適宜北方干旱地區(qū)種植的冬油菜品種, 但其抗旱機(jī)制尚不明確, 并且與白菜型油菜光合作用相關(guān)的基因克隆及生物信息學(xué)分析鮮有報(bào)道, 分離和克隆與之相關(guān)基因?qū)γ鞔_白菜型冬油菜在干旱脅迫反應(yīng)中響應(yīng)機(jī)制及抗旱機(jī)理具有重要意義。本研究應(yīng)用雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)技術(shù), 得到干旱誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白R(shí)uBisCo, 并進(jìn)一步對(duì)和基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析, 以全面了解該基因在白菜型冬油菜隴油7號(hào)中的生物學(xué)功能, 為培育新的抗旱品種以及轉(zhuǎn)基因抗旱冬油菜的探究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以白菜型冬油菜抗旱品種隴油7號(hào)為試材, 選取籽粒飽滿、大小一致的種子, 10%過氧化氫處理30 min, 無菌水沖洗2~3次, 置鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)催芽(光照14 h, 30°C; 黑暗10 h, 28°C), 待種子露白后, 播于裝有育苗基質(zhì)的花盆(14 cm×13 cm), 每盆4株幼苗, 于人工培養(yǎng)箱中(光照14 h, 25°C; 黑暗10 h, 20°C)培養(yǎng)45 d至六葉期。干旱脅迫各處理為5盆, 處理分為對(duì)照組(CK)和中度干旱組(MR), 各組對(duì)應(yīng)田間最大持水量的70%~75%、40%~45%[11-12]。處理期間每日下午18:00, 用HM-S型(山東恒美電子科技有限公司)土壤水分儀測(cè)量每日土壤含水量, 并用量筒定量補(bǔ)充水分以控制土壤含水量。干旱脅迫7 d。待脅迫處理結(jié)束, 取第4片幼嫩葉片冷凍保存, 取MR及CK葉片提取總蛋白和總RNA。試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

于處理第7天上午9:30至11:00, 選取完全展開葉, 采用LI-6400便攜式光合儀測(cè)定葉片光合參數(shù)氣孔導(dǎo)度(G)、凈光合速率(n)、胞間CO2濃度(i)、蒸騰速率(r); 測(cè)定時(shí)葉室(2 cm×3 cm)內(nèi)溫度為20℃, 光強(qiáng)為600 μmol m–2s–1; 選每個(gè)處理5~10株, 每株讀數(shù)3次; 參照龔富生等[13]的方法測(cè)定RuBPCase 活性。稱取完全展開葉0.5 g, 加2 mL Tris-HCl (pH 7.4)冰浴研磨后置2 mL離心管。4℃下1317×離心15 min, 取上清液待測(cè)。根據(jù)NADPH的氧化或NADP+的還原, 340 nm 測(cè)定樣品的吸光值, 計(jì)算酶活力。

1.2 白菜型冬油菜葉片蛋白質(zhì)篩選與分析

1.2.1 總蛋白提取與蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 采用TCA-丙酮沉淀法[14]提取白菜型冬油菜葉片總蛋白, 并用Bradford[15]法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.2 蛋白質(zhì)雙向電泳 對(duì)干旱脅迫處理組(MR)和對(duì)照(CK)使用pH 4~7、17 cm的IPG膠條, 按照GE Healthcare雙向電泳操作手冊(cè)說明操作, 略有修改。樣品上樣量為1000mg, 將樣品與水化液按體積比1∶4混勻, 總體積不超過500mL, 按說明書程序進(jìn)行第一向等電聚焦電泳, 采用12%酰胺凝膠進(jìn)行第二向SDS-PAGE, 經(jīng)考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色、脫色后, 采用GS-900 Calibrated Densitometer圖像掃描系統(tǒng)(Bio-Rad)對(duì)凝膠進(jìn)行圖像掃描, 用ImageMaster 2D Platium 7.0凝膠分析軟件對(duì)圖譜標(biāo)準(zhǔn)化處理, 蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配和生物統(tǒng)計(jì), 確定差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。

1.2.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定 對(duì)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)回收、酶解, 送往華大基因股份公司(北京)進(jìn)行LC-MS鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照Spectru植物試劑盒(Sigma公司)提取總RNA, 電泳檢測(cè)后按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(大連TaKaRa公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 得到單鏈cDNA, 測(cè)定其濃度后, 置–20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)與rbcL和rbcS基因克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的白菜型油菜(Gene ID: 106352579)和(Gene ID:103863779)基因的核苷酸序列, 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,-F: 5'-ATGTCACCACAAACAGAGACT-3',-R: 5'-CTACTCTTGGCCATCTAATTT-3',-F: 5'-ATGGC TTCCTCTATGCTTTC-3',-R: 5'-TTAAGCACCGGT GAAGCTTG-3'按照十字花科首位序列上設(shè)計(jì), 可擴(kuò)增出編碼區(qū)全序列。以未經(jīng)干旱處理的隴油7號(hào)葉片反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板, 利用引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增程序?yàn)?5.0°C預(yù)變性5 min; 94.0°C變性30 s, 退火57.0°C 30 s, 72.0°C延伸80 s, 共循環(huán)35次; 最后72°C延伸, 保持10 min; 4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 利用天根生化科技(北京)有限公司的普通瓊脂糖凝DNA純化回收試劑盒并回收目的條帶?；厥债a(chǎn)物與pMD-19T載體連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞, 過夜培養(yǎng), 藍(lán)白斑篩選, 挑白斑進(jìn)行菌液培養(yǎng)。PCR檢測(cè)菌落后, 隨機(jī)挑選3個(gè)陽性克隆送華大基因股份公司(北京)股份有限公司測(cè)序。

1.5 rbcL和rbcS預(yù)測(cè)蛋白的生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域等預(yù)測(cè)均參考齊國(guó)昌[8]; 采用SWISS- MODEL工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu), 并采用PyMOL軟件對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)查看處理。利用Blast從GenBank中挑選9個(gè)來源于十字花科植物的和基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列; 利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比較和氨基酸同源性分析; 采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.6 白菜型冬油菜rbcL和rbcS在干旱脅迫下的表達(dá)量

根據(jù)白菜型油菜和的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)定量表達(dá)引物-S: 5'-GCAACGGGAAACGGGTGTT-3',-A: 5'-AGCGACCTTGAAGATTCTGGAGT-3',-S: 5'-GCTGCTGTGGTTACCTCCC-3',-A: 5'-TGTCGTT GTTTGCTTTGCG-3'。以濃度一致的隴油7號(hào)葉片cDNA為模板,: Act-F: 5'-TGTGCCAATCTACGAGGG TTT-3'; Act-R: 5'-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3'為內(nèi)參, 進(jìn)行熒光定量和半定量PCR。半定量RT-PCR采用同機(jī)分管擴(kuò)增內(nèi)參基因和目的基因, 電泳檢測(cè)和基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)模式, PCR擴(kuò)增程序同上, 退火溫度為60°C。參考SYBR Premix ExII (TliRNaseH Plus)試劑盒(大連TaKaRa公司)的熒光定量PCR, 采用兩步法, 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 2 min; 95°C 10 s, 60°C 35 s, 40個(gè)循環(huán)。96孔上樣板目的基因與內(nèi)參基因?qū)?yīng)各3次重復(fù), 避光操作。采用2–ΔΔCt方法計(jì)算[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫冬油菜差異蛋白質(zhì)篩選

采用ImageMaster 2D Plantium圖像分析軟件分析隴油7號(hào)葉片中度脅迫組(MR)與對(duì)照組(CK)的差異蛋白斑點(diǎn)(圖1), 進(jìn)行自動(dòng)匹配, 并結(jié)合肉眼觀察及手動(dòng)調(diào)整, 共檢測(cè)到1135~1478個(gè)的蛋白點(diǎn), 干旱脅迫前后, 共有343個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的豐度變化, 表達(dá)量變化在8倍以上的蛋白點(diǎn)為21個(gè), 其中, 增量表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)共9個(gè)(spots 1, 3, 7, 9~13, 15), 減量表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)8個(gè)(spots 4, 6, 8, 14, 17, 18, 20, 21), 誘導(dǎo)蛋白點(diǎn)4個(gè)(spots 2, 5, 16, 19)。正常水分條件下這些蛋白豐度較低或不表達(dá), 干旱脅迫下表達(dá)發(fā)揮功能, 植物體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化變化, 進(jìn)而植物耐受或抵御干旱環(huán)境的脅迫。

2.2 干旱脅迫冬油菜差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定及功能注釋

切取干旱脅迫后誘導(dǎo)表達(dá)的21個(gè)蛋白點(diǎn)(圖1, spots 1~21), 用胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解, 經(jīng)LC-MS質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索, 最后成功鑒定到21個(gè)蛋白質(zhì)(表1)。參與刺激響應(yīng)蛋白6個(gè)(spots 1, 2, 7, 8, 13, 16)、能量代謝蛋白6個(gè)(spots 6, 9, 11, 15, 17, 20)、脂代謝蛋白1個(gè)(spot 14)、糖代謝蛋白1個(gè)(spot 19)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程蛋白1個(gè)(spot 21)、伴侶蛋白2個(gè)(spots 12, 18)、蛋白質(zhì)代謝蛋白1個(gè)(spot 5)、光合作用蛋白3個(gè)(spots 3, 4, 10)。spot 4為葉綠體RuRisCo F1小鏈, 表達(dá)量下調(diào)10倍(表1)。

圖1 白菜型冬油菜隴油7號(hào)雙向電泳圖

A: pH 4~7對(duì)照; B: pH 4~7干旱處理。

A: pH 4–7 contrast; B: pH 4–7 drought stress treatment.

2.3 rbcL和rbcS基因克隆

本實(shí)驗(yàn)鑒定的21個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)中3個(gè)蛋白點(diǎn)與光合作用相關(guān), 其中spot 4為光合固碳酶Rubisco F1小鏈蛋白表達(dá)豐度下調(diào)10倍, 故克隆RuBisCo亞基和基因。以隴油7號(hào)cDNA為模板, 以1.4所述為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增, 分別得到一條1550及600 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物, 回收純化片段, 連接到T載體后轉(zhuǎn)化, 利用菌液PCR篩選陽性克隆, 分別得到一條1500 bp及600 bp左右的目的片段, 說明克隆的基因已插入載體中。陽性克隆送華大基因(北京)股份有限公司測(cè)序得到堿基序列, 全長(zhǎng)為1105 bp和552 bp。

2.4 白菜型冬油菜rbcL和rbcS蛋白特性分析

采用NCBI ORF finder軟件對(duì)白菜型冬油菜和基因編碼蛋白質(zhì)的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他十字花科植物的對(duì)應(yīng)基因編碼蛋白質(zhì)序列比對(duì)顯示, 編碼蛋白質(zhì)序列基本一致。的完整開放閱讀框1095 bp, 編碼364個(gè)氨基酸(圖2-A)。完整的開放閱讀框546 bp, 編碼181個(gè)氨基酸(圖2-B)。

預(yù)測(cè)rbcL蛋白質(zhì)理化性質(zhì)表明, 白菜型冬油菜rbcL蛋白由20種氨基酸組成, 相對(duì)分子量(MW)為40.29 kDa, 等電點(diǎn)(pI) 6.70; 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示rbcL是一個(gè)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì), 不穩(wěn)定指數(shù)(instability index, II>40為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)) 41.67; 脂融指數(shù)(aliphatic index, AI)為83.63, 平均親水性值(grand average of hydropathicity, GRAVY)為-0.232, 為親水性蛋白質(zhì)。冬油菜rbcS蛋白主要由20種氨基酸組成, MW為20.32 kDa, pI為8.23, II為33.66, 為穩(wěn)定蛋白質(zhì), 并且, AI為74.86, GRAVY為-0.142, 為親水性蛋白質(zhì)。

2.5 rbcL和rbcS蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

冬油菜rbcL跨膜結(jié)構(gòu)存在3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, 第1~18位氨基酸由里向外螺旋, 第145~169位氨基酸由外向里螺旋, 第247~267位氨基酸由里向外螺旋, N-端信號(hào)序列無信號(hào)肽斷裂點(diǎn), 二級(jí)結(jié)構(gòu)包括38.74% α-螺旋、10.99%延伸鏈及50.27%自由卷曲, 新生rbcL肽鏈經(jīng)過組裝、加工后在細(xì)胞內(nèi)與小亞基組成成熟的RuBisCo光合固碳酶。冬油菜rbcS存在一個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域, 第1~18位氨基酸由里向外螺旋, N-端信號(hào)序列不是一個(gè)信號(hào)多肽, 二級(jí)結(jié)構(gòu)包含16.02% α-螺旋、28.73%延伸鏈及55.25%自由卷曲組成, 成熟的rbcS最終在綠色細(xì)胞內(nèi)行使其功能。

表1 LC-MS鑒定結(jié)果

(續(xù)表1)

序號(hào)Spot No.登錄號(hào)Accession蛋白名稱Protein name分子量/等電點(diǎn)MW/pI得分Score來源Resource上調(diào)/下調(diào)Up/down 9gi|356494238磷酸甘露糖異構(gòu)酶 Phosphomannomutase27.9 kDa/5.2395.6大白菜Brassica rapa subsp. chinensis+13 10gi|29778743|葉綠體β-碳酸酐酶Chloroplast beta-carbonic anhydrase37.7kDa/6.00106甘藍(lán)型油菜Brassica napus+11 11gi|14009294假定的6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶Putative 6-phosphogluconolactonase29.3 kDa/5.90114埃塞俄比亞芥Brassica carinata+14 12gi|15234962DNAJ熱激蛋白N-端結(jié)構(gòu)域DNAJ heat shock N-terminal domain-containing protein38.4 kDa/7.3850.8擬南芥Arabidopsis thaliana+12 13gi|211905345上皮硫特異蛋白Epithiospecifier protein37.9kDa/5.7173.8白菜Brassica rapa subsp. pekinensis+15 14gi|62321480脂氧合酶Lipoxygenase103.3 kDa/5.3696.4擬南芥Arabidopsis thaliana–14 15gi|89257686假定的乙酰鳥苷酸脫乙酰基酶Acetylornithine deacetylase, putative48.0 kDa/5.62129.0甘藍(lán)Brassica oleracea+12 16gi|19553697|β-1,3-葡聚糖酶Beta-1,3-glucanase38.9 kDa/4.8995.6大白菜Brassica rapa subsp. chinensis+16 17gi|356494248L-半乳糖脫氫酶L-galactose dehydrogenase34.9 kDa/5.0868大白菜Brassica rapa subsp. chinensis–9 18gi|41584275熱休克同源蛋白70Heat shock cognate protein 7028.1 kDa/5.1765.7山崳菜Eutrema halophilum–16 19gi|28540855可溶性淀粉合成酶Soluble starch synthase71.6 kDa/5.24103白菜Brassica rapa subsp. pekinensis+17 20gi|15229519二羥丙酮激酶Dihydroxyacetone kinase61.9 kDa/5.22111擬南芥Arabidopsis thaliana–11 21gi|197245081玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶Zeaxanthin epoxidase79.8 kDa/5.67108甘藍(lán)型油菜Brassica napus–13

“+”、“–”符號(hào)表示上下調(diào)。 “+”,” –” indicates up-/down-regulated expression.

SWISS-MODEL預(yù)測(cè)rbcL三級(jí)結(jié)構(gòu), 模型序列區(qū)分度達(dá)到93.75, 構(gòu)建模型的序列相似度達(dá)到0.60, 序列覆蓋率達(dá)到0.99, 模型質(zhì)量評(píng)估函數(shù)QMEAN達(dá)到-1.62, 為1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(長(zhǎng)鏈) (圖3-A)。POCASA預(yù)測(cè)顯示, rbcL蛋白共5個(gè)活性口袋。冬油菜rbcS三級(jí)結(jié)構(gòu), 模型序列覆蓋率達(dá)到0.68, 序列區(qū)分度達(dá)到73.98, 序列相似性達(dá)到0.56, QMEAN達(dá)到-1.60, 為1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(小鏈) (圖3-B)。rbcS共4個(gè)活性口袋, 為rbcS底物結(jié)合區(qū)。

rbcL蛋白保守區(qū)域?qū)儆赗uBisCo Large superfamily, 存在第40~347位氨基酸的保守區(qū)域, 第84位氨基酸是一個(gè)催化位點(diǎn), 第86、87位為2個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn), 均與光合作用有光?；蚴怯扇~綠體DNA編碼, 具有高的保守性, 冬油菜rbcL蛋白質(zhì)保守域與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他植物有相似特征保守域。冬油菜rbcS蛋白保守區(qū)域存在20個(gè)多聚體結(jié)合位點(diǎn), 在第2~44位氨基酸之間的rbcS superfamily保守區(qū)域及第65~175位氨基酸之間的RuBisCo small like superfamily的保守區(qū)域, 均與光合作用相關(guān)。

2.6 rbcL和rbcS氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

rbcL親緣關(guān)系分兩類, 含大白菜(subsp, AHY18972.1)、甘藍(lán)型油菜(, AMR44349.1)、白菜型油菜(, AKG25031.1)、甘藍(lán)(, P48686.1)所屬的蕓薹屬為一類, 并與之親緣關(guān)系較近, 氨基酸序列相似度達(dá)到99%; 蘿卜(L., YP_009175683.1)所屬的蘿卜屬、黑芥(, AEK33921.1)、擬南芥(, AMR44347.1)所屬的鼠耳芥屬、沙芥(, YP_009230829.1)所屬的沙芥屬、亞麻薺 (, YP_009231083.1)所屬的薺菜屬為一類, 序列相似度達(dá)到98% (圖4-A)。rbcS的親緣關(guān)系分兩類, 含白菜型油菜(ABL97962.1)、甘藍(lán)型油菜(ABB51649.1)、大白菜(BAJ08160.1)、甘藍(lán)(XP_013635885.1)、芥菜型油菜(, AEB00556.1)所屬的蕓薹屬及亞麻薺(XP_010450911.1)所屬的薺菜屬為一類, 序列相似度達(dá)到95%以上, 其中隴油7號(hào)與甘藍(lán)的關(guān)系最近(相似度99%); 擬南芥(CAA32701.1)所屬的鼠耳芥屬、蘿卜(XP_006405 770.1)所屬的蘿卜屬、山崳菜(, XP_006405770.1)所屬的山萮菜屬為一類, 序列相似度達(dá)到94%以上(圖4-B)。可見不同植物的rbcL和rbcS進(jìn)化具有明顯的種屬特性。

圖2 rbcL和rbcS基因的編碼區(qū)核酸序列及編碼氨基酸序列

上游的起始密碼子ATG用方框表示; *為終止密碼的位置。

An upstream start codon ATG is boxed; * indicates the positions of termination codon.

圖3 白菜型冬油菜rbcL和rbcS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)及活性口袋

A: rbcL蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu); B: rbcS蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu); 紫色箭頭表示不同活性口袋。

A : rbcL protein tertiary structure; B: rbcS protein tertiary structure; purple shows differential pockets.

2.7 干旱脅迫下rbcL和rbcS基因的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示, 冬油菜遭受干旱脅迫, 冬油菜和基因表達(dá)量分別下降到CK的51.90%、68.97%, 差異達(dá)到顯著水平(<0.05)(圖5-A, 圖5-B)。說明干旱脅迫嚴(yán)重影響冬油菜光合作用, 光合作用關(guān)鍵酶基因表達(dá)量下調(diào), 是影響光合作用下降的因素。

圖4 rbcL和rbcS蛋白與其他相關(guān)物種蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 干旱脅迫下白菜型冬油菜rbcL和rbcS基因的半定量RT-PCR分析及相對(duì)表達(dá)量

CK: 對(duì)照組; MR: 中度干旱組。CK: control; MR: middle drought stress.

2.8 干旱脅迫下白菜型冬油菜葉片光合氣體交換參數(shù)及RuBPcase活性變化

隨著干旱程度的加強(qiáng), 白菜型冬油菜葉片s、r、n、i明顯降低(表2)。表明葉片光合同化消耗CO2能力減弱, 通過氣孔進(jìn)入葉片的CO2在胞間積累, 導(dǎo)致C升高, 此時(shí)葉片n下降的主要原因是非氣孔限制, 即光合系統(tǒng)效率降低所致。隨著干旱脅迫的加強(qiáng), 白菜型冬油菜葉片RuBPCase活性顯著降低。與對(duì)照(CK)相比, 中度干旱下葉片RuBPCase活性下降了52.58%, 處理間差異達(dá)到顯著水平。

表2 干旱脅迫對(duì)白菜型冬油菜‘隴油7號(hào)’光合氣體交換參數(shù)及RuBPcase活性的影響

CK: 對(duì)照組; MR: 中度干旱組。CK: control; MR: middle drought stress.

3 討論

干旱條件下, 氣孔關(guān)閉或部分關(guān)閉(氣孔限制)及光合葉肉細(xì)胞光合能力的下降(非氣孔限制)是光合速率下降的主要原因。RuBisCo是植物光合作用的關(guān)鍵酶, 既能催化1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)與CO2形成3-磷酸甘油酸的反應(yīng), 又能催化RuBP與O2氧化裂解形成3-磷酸甘油酸、磷酸和磷酸乙醇酸的加氧反應(yīng), 具有雙重作用, 其活性及細(xì)胞內(nèi)含量受到逆境壓力的影響[16]?？购灯贩N在干旱條件下能維持相對(duì)較高的光合作用。本研究顯示, 干旱脅迫下, 冬油菜葉片光合氣孔參數(shù)i、n、r、s及光合作用關(guān)鍵酶RuBisCo活性顯著下降, 葉片光合作用下降。前人研究顯示, 非氣孔限制下, RuBP羧化酶活性的降低、光合磷酸化活性的降低、RuBisCo及PEP羧化酶活性的降低等是影響植物光合作用下降的主要因素。作為光合作用固碳關(guān)鍵酶, RuBisCo活性降低亦是植物光合速率下降的非氣孔限制因素之一[17-20]。

高等植物葉綠體DNA是一個(gè)閉合的環(huán)形雙鏈DNA, 進(jìn)化過程中具有較高的保守性[7], 可以從系統(tǒng)進(jìn)化上解釋物種進(jìn)化的多樣性, rbcL是由葉綠體DNA編碼, 并且RuBisCo酶的底物結(jié)合中心及活性中心均位于大亞基, 進(jìn)化過程中保守性較高, 在系統(tǒng)發(fā)育研究中能確定種屬間差異。rbcS是由核基因組編碼, 能調(diào)節(jié)RuBisCo的蛋白質(zhì)活性[11]。本實(shí)驗(yàn)從白菜型冬油菜葉片克隆到了具有完整ORF的和cDNA序列。編碼區(qū)由1095 bp堿基組成, 編碼364個(gè)氨基酸序列, 屬于親水性蛋白, 具有RuBisCo Large superfamily保守域, 該基因與十字花科大白菜、甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、甘藍(lán)等氨基酸序列具有較高的相似性, α-螺旋和自由卷曲是其二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要原件, 5個(gè)不同活性口袋區(qū)域、1個(gè)催化位點(diǎn)、2個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)是其三級(jí)結(jié)構(gòu)重要結(jié)構(gòu)區(qū)域;編碼區(qū)由549 bp堿基組成, 編碼181個(gè)氨基酸序列, 是親水性蛋白, 具有rbcS superfamily和RuBisCo small like superfamily兩個(gè)保守區(qū)域, 該蛋白與甘藍(lán)rbcS同源關(guān)系最近(序列相似性達(dá)99%), 延伸鏈及自由卷曲是其二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要原件, 20個(gè)多聚體結(jié)合位點(diǎn)及4個(gè)活性口袋是其三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要區(qū)域。本研究中, 中度脅迫下,和基因表達(dá)量均下降, 說明干旱影響了植物基因表達(dá), 光合關(guān)鍵酶RuBisCo合成受阻, 影響光合作用, 植物生長(zhǎng)發(fā)育過程受到阻礙。

為了提高植物固定CO2的能力及光合作用效率, 研究者對(duì)多種植物RuBisCo大小亞基的結(jié)構(gòu)及功能等方面進(jìn)行了大量研究[20-24]。這些研究結(jié)果為采用生物技術(shù)的方法獲得高光合利用率的作物品種提供了可能。本試驗(yàn)首先采用2-DE獲得了干旱脅迫下白菜型冬油菜的差異表達(dá)蛋白R(shí)uBiSCo亞基, 以此克隆了RuBisCo的大小亞基的完整cDNA片段, 并預(yù)測(cè)了其結(jié)構(gòu)及功能, 為獲得高RuBisCo活性的白菜型冬油菜品種提供了依據(jù)。

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Cloning of RuBisCo Subunits Genesandfrom Winter Rapeseed () and Their Expression under Drought Stress

MI Chao2,**, ZHAO Yan-Ning2,**, LIU Zi-Gang1,*, CHEN Qi-Xian3,*, SUN Wan-Cang1,2, FANG Yan1, LI Xue-Cai1,2, and WU Jun-Yan1,2

1Gansu Research Center of Rapeseed Engineering and Technology / Improvement and Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement of Gansu Province / Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Sciences, Lanzhou 730070, Gansu, China;2College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China;3Gansu General Station of Agro-technology Extension, Lanzhou 730070, Gansu, China

In this study, we used the two-dimensional gel electrophoresis (2D-DIGE) technology combined with the liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) technology to filtrate the differential protein small subunit of RuBisCo which was related to photosynthesis in winter rapeseed () under drought stress. According to the publishedRuBisCo subunit conserved sequences ofand, we designed the primers and used the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) technology to amplify the cDNA sequence in Longyou 7. We obtained the open reading frame (ORF) of the RuBisCo subunitand, which had the length 1095 bp and 549 bp, and encoded the proteins contains 364 and 181 amino acids, respectively. The results of bioinformatics analysis showed that compare withsubsp.and, the protein homology of rbcL and in Longyou 7 was above 99%, with the conserved domain sequence belonging to RuBisCo large superfamily. The theoretical relative molecular mass and isoelectric point of rbcL were 40.29 kDa and 6.70, respectively. And the instability index was-41.67 (II> 40 was considered as unstable protein), showing that it was an unstable protein. The aliphatic index was 83.63 and the grand average of hydropathicity was 0.232, which indicated that it was a hydrophilic protein. The secondary structure included 38.74% alpha helix, 10.99% extended strand and 50.27% random coil. And the tertiary structure contained five differential activity pockets. The protein homology of rbcS andin Longyou 7 was 99%, that conserved domain sequence was contained the rbcS superfamily and the RuBisCo Small like superfamily, which theoretical relative molecular mass and isoelectric point were 20.32 kDa and 8.23, respectively. The instability index was 33.66, showing that was a stable protein, and the aliphatic index was 74.86, the grand average of hydropathicity was-0.142, showing a hydrophilic protein. The secondary structure included 16.02% alpha helix, 28.37% extended strand and 55.25% random coil. And the tertiary structure contained four differential activity pockets. Real-time quantitative and semi-quantitative results showed that, the expression ofandin winter rapeseed leaves under drought stress was down-regulated, which was the reason of decreasing photosynthesis. In addition, the decreased net photosynthesis rate (n) in winter rapeseed leaves was related to the inhibited RuBPCase expression and decreased RuBPCase activity, and the non-stomatal limitation was the main factor of declinedn.

winter rapeseed ();;; drought stress

2017-09-21;

2018-08-20;

2018-09-18.

10.3724/SP.J.1006.2018.01882

通信作者(Corresponding authors): 劉自剛, E-mail: 739015868@qq.com; 陳其鮮, E-mail: cqxwin@163.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

E-mail: zynmc228502@163.com; E-mail: zjnn228@163.com

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660404), 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0100502), 甘肅省高?？蒲谐晒D(zhuǎn)化培育項(xiàng)目(2018D-13), 甘肅省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金, 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-13)和甘肅省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(17ZD2NA016-4)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31660404), the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0101502), Transformation and Cultivation of Scientific Research Achievements in Universities in Gansu (2018D-13), Special Funds for the Construction of Modern Agricultural Technology System in Gansu, the National Modern Agro-industry Technology System (CARS-13), and Gansu Science and Technology Major Project (17ZD2NA016-4).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180915.1120.002.html