轉(zhuǎn)cry1C*及cry2A*基因早粳稻Bt蛋白的時空表達(dá)和抗螟蟲性

李榮田 王新宇 田崇兵 周 青 劉長華,2,*

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轉(zhuǎn)及*基因早粳稻Bt蛋白的時空表達(dá)和抗螟蟲性

李榮田1王新宇1田崇兵1周 青1劉長華1,2,*

1黑龍江大學(xué)/ 分子生物學(xué)黑龍江省高校重點實驗室, 黑龍江哈爾濱 150080;2黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150080

早粳稻空育131為受體, 以根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法創(chuàng)制了轉(zhuǎn)啟動子調(diào)控下的及基因早粳稻空育131 (*)和空育131(*)。為了研究轉(zhuǎn)基因水稻Bt蛋白的時空表達(dá)特性及抗螟蟲性, 將不同轉(zhuǎn)化事件形成的轉(zhuǎn)基因早粳稻品系種植于田間, 利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測轉(zhuǎn)基因水稻不同生長發(fā)育階段不同器官的、以及成熟期糙米的Bt蛋白量, 采用室內(nèi)離體莖稈法接蟲鑒定轉(zhuǎn)基因水稻的抗螟蟲性。結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)基因早粳稻不同抗蟲基因Bt蛋白量不同,*基因總是低于基因的蛋白質(zhì)表達(dá)量; 不同生長發(fā)育時期Bt蛋白量不同, 葉片和莖鞘等器官的Bt蛋白量為分蘗期<抽穗期<灌漿期, 幼穗或糙米等器官的Bt蛋白量為抽穗期幼穗>灌漿期幼穗>成熟期糙米; 不同器官Bt蛋白量不同, 高低次序在分蘗期為葉片、莖鞘, 抽穗期為葉片、幼穗和莖鞘, 灌漿及成熟期為葉片、莖鞘、幼穗和糙米; 同一抗蟲基因不同轉(zhuǎn)基因品系間抽穗期葉片、莖鞘和幼穗等器官Bt蛋白量及抗螟蟲性、糙米Bt蛋白量等性狀存在差異, 抽穗期各器官Bt蛋白量與抗螟蟲性及成熟期糙米Bt蛋白量之間相關(guān)不顯著, 不論Bt蛋白量高或低的品系均表現(xiàn)為高抗螟蟲。轉(zhuǎn)基因早粳稻營養(yǎng)器官生長發(fā)育前期Bt蛋白量較低、后期較高, 繁殖器官生長發(fā)育早期Bt蛋白量較高、晚期較低, 營養(yǎng)器官通常比繁殖器官的Bt蛋白量高。在本研究范圍內(nèi), 不同基因及不同轉(zhuǎn)化事件培育的轉(zhuǎn)基因水稻Bt蛋白表達(dá)量高低不同, 但所有的轉(zhuǎn)基因早粳稻品系均表現(xiàn)高抗螟蟲。

基因;基因; 轉(zhuǎn)基因早粳稻; Bt蛋白; 時空表達(dá); 抗螟蟲性

水稻L.)作為最重要的糧食作物之一,在其生長和發(fā)育的過程中, 常常遭受螟蟲的危害, 每年造成的損失占水稻病蟲害損失的50%以上[1]。其中, 危害最大的二化螟在我國分布很廣, 除少數(shù)地區(qū)外, 南北稻區(qū)都有分布[2]?；瘜W(xué)藥劑防治螟蟲效果較好, 但存在污染環(huán)境等問題[3]。培育抗蟲水稻品種是防治螟蟲最經(jīng)濟(jì)有效措施。栽培水稻及其近緣種中缺少抗螟蟲基因, 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻抗蟲性已成為抗蟲育種的新途徑。我國轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻培育具世界先進(jìn)水平, 一批轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻新品系已經(jīng)進(jìn)入了環(huán)境釋放試驗和生產(chǎn)性試驗階段, 有的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻獲得了安全性證書[4]。作物轉(zhuǎn)基因抗蟲遺傳改良所用的外源基因一般包括凝集素基因[5-8]、毒素基因[9-12]、酶抑制劑基因[13]、以及等基因[14], 其中以基因應(yīng)用最普遍、最成功[9,15]。(Bt)是革蘭氏陽性菌, 在形成芽孢時產(chǎn)生殺蟲毒素。Bt殺蟲毒素是一類蛋白質(zhì), 被稱作Bt蛋白, 由基因編碼[16]。Bt蛋白具有很高的殺蟲專一性, 不會對人類及其他動物產(chǎn)生毒害[17]。根據(jù)水稻密碼子偏愛性, 以基因和基因為藍(lán)本經(jīng)過密碼子優(yōu)化并人工合成了基因和基因[17-19]。轉(zhuǎn)或基因的秈稻表現(xiàn)出穩(wěn)定的、較好的抗螟蟲性[18,20-22]。另外據(jù)研究, 轉(zhuǎn)基因植物Bt蛋白的表達(dá)量與環(huán)境及遺傳背景有關(guān)。高溫導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉Bt蛋白含量降低[23-24], 遺傳背景會影響B(tài)t抗蟲棉Bt蛋白的表達(dá)[25]。黑龍江省是我國粳稻最大產(chǎn)區(qū), 具有日照長、氣溫低及晝夜溫差大等獨特的環(huán)境條件, 水稻生產(chǎn)中受二化螟危害嚴(yán)重[26]。利用在秈稻中抗蟲性明確的和基因轉(zhuǎn)化早粳稻, 培育轉(zhuǎn)基因抗蟲早粳稻品種, 有利于黑龍江省水稻生產(chǎn)發(fā)展。研究轉(zhuǎn)基因早粳稻田間Bt蛋白質(zhì)表達(dá)特性, 分析不同轉(zhuǎn)化事件形成的轉(zhuǎn)基因早粳稻品系Bt蛋白量差異及其與抗蟲性關(guān)系, 可為培育農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因抗蟲早粳稻品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)基因早粳稻及其田間種植

水稻空育131 (), 代碼HD1。以其為受體, 通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Ti質(zhì)粒pBar13-的T-DNA區(qū)(圖1-A)導(dǎo)入水稻核基因組。從不同的遺傳轉(zhuǎn)化事件培育了4個遺傳穩(wěn)定的、農(nóng)藝性狀符合育種目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因水稻品系, 即HD1-1、HD1-2、HD1-3和HD1-4。

水稻空育131 (), 代碼HD2。與空育131 ()的創(chuàng)制類似, 通過根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pBar13-的T-DNA區(qū)(圖1-B)導(dǎo)入早粳稻空育131。來自于不同遺傳轉(zhuǎn)化事件的4個遺傳穩(wěn)定的、農(nóng)藝性狀符合育種目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因水稻品系, 即HD2-1、HD2-2、HD2-3和HD2-4。

圖1 Ti質(zhì)粒pBar13-cry1C*(A)和pBar13-cry2A*(B)的T-DNA區(qū)

RB: 右邊界; ubi: ubi啟動子;:基因;:基因; 35S: CaMV35S啟動子;: 膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因; LB: 左邊界。

RB: right border; ubi: ubi promoter;:gene;:gene; 35S: CaMV35S promoter;: phosphinothricin acetyltransferase gene; LB: left border.

在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)轉(zhuǎn)基因水稻試驗基地種植轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1-1、HD1-2、HD1-3和HD1-4, 以及HD2-1、HD2-2、HD2-3和HD2-4共8個品系。田間試驗設(shè)計采用隨機(jī)區(qū)組法, 3次重復(fù)。小區(qū)6行區(qū), 5 m行長, 插秧規(guī)格為行距30 cm、株距12 cm、每蔸插2棵秧苗, 小區(qū)面積為9 m2。育苗、插秧、施肥、水管理、防病等與一般生產(chǎn)田相同, 不進(jìn)行二化螟等蟲害防治。

1.2 Bt蛋白量檢測

在水稻分蘗期、抽穗期、灌漿期, 從田間每小區(qū)隨機(jī)選取3蔸水稻, 取每蔸主莖上部葉片、莖鞘及幼穗等3個部位, 用滅菌的錫箔紙包好置液氮中保存, 室內(nèi)檢測水稻各器官樣品的Bt蛋白量。成熟期收獲小區(qū)稻谷, 室內(nèi)加工糙米, 檢測糙米Bt蛋白量。

利用武漢上成生物科技有限公司“轉(zhuǎn)基因Bt Cry1C酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒”檢測水稻樣品基因Bt蛋白量, 利用“轉(zhuǎn)基因Bt Cry2A酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒”檢測水稻樣品基因Bt蛋白量。依據(jù)武漢上成生物科技有限公司的Cry1C和Cry2A酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒說明書, 用TECAN Infinite200型酶標(biāo)儀, 檢測樣品450 nm OD值; 以試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo), 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線; 稱量、抽提液研磨及稀釋水稻樣品, 檢測稀釋后水稻樣品OD值, 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算稀釋后水稻樣品Bt蛋白濃度; Bt蛋白量(μg g–1) = 稀釋后水稻樣品Bt蛋白濃度(μg mL–1)×稀釋倍數(shù)×抽提液體積(mL)/水稻樣品鮮重(g)。對每個水稻樣品Bt蛋白量檢測2次, 2次差異在5%以內(nèi)為有效數(shù)據(jù), 2次的平均值為該小區(qū)該時空水稻Bt蛋白量。

1.3 螟蟲抗性鑒定

二化螟一齡期的幼蟲用于水稻接蟲。二化螟蟲卵由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻害蟲研究室侯茂林教授惠贈。

在水稻抽穗期, 隨機(jī)選每小區(qū)3蔸水稻, 取每蔸一莖稈并截取其基部5 cm。于室內(nèi)將莖稈基部包裹濕紗布, 以保持莖稈新鮮不脫水, 將同一個小區(qū)的3個莖稈放在1個試管中。每個試管接二化螟一齡期幼蟲30頭, 平均每個莖稈接蟲10頭。封閉試管口防止昆蟲逃逸及水分蒸發(fā)。在28℃、相對濕度90%以上、光照3000 μmol m–2s–1、12 h光照/12 h黑暗條件放置, 7 d后統(tǒng)計死蟲數(shù), 計算二化螟死亡率及校正死亡率。二化螟死亡率= (接蟲數(shù)– 活蟲數(shù))/接蟲數(shù)×100%, 二化螟校正死亡率= (轉(zhuǎn)基因早粳稻品系二化螟死亡率– 對照CK二化螟死亡率)/(100 – 對照CK二化螟死亡率)×100%。對照CK為水稻空育 131。以二化螟校正死亡率高低代表螟蟲抗性強(qiáng)弱。

1.4 數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)基因或基因早粳稻Bt蛋白量和二化螟死亡率及二化螟校正死亡率等性狀以小區(qū)平均數(shù)為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析比較。各轉(zhuǎn)基因品系Bt蛋白量是3個小區(qū)的Bt蛋白量平均值, HD1及HD2不同生長發(fā)育階段及器官的Bt蛋白量是各自4個不同品系的Bt蛋白量平均值。利用Microsoft Excel 2003及SPSS21.0軟件進(jìn)行方差及相關(guān)性等統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)不同基因早粳稻Bt蛋白量

由圖2可知, 葉片Bt蛋白量, 在分蘗期、抽穗期和灌漿期, 轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1均明顯地低于轉(zhuǎn)基因早粳稻HD2; 與葉片類似, 莖鞘中Bt蛋白量, 在水稻各個生長發(fā)育階段, 轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1均顯著地低于HD2; 幼穗或糙米中Bt蛋白量, 在抽穗期HD1比HD2顯著低, 水稻生長發(fā)育到灌漿期及成熟期, HD1水稻雖然仍低于HD2水稻, 但是差異變得不明顯。這表明, 在早粳稻中基因蛋白質(zhì)表達(dá)量低于蛋白質(zhì)表達(dá)量, 在營養(yǎng)器官及生長發(fā)育前期, 這種差異更加明顯。

圖2 轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1和HD2的Bt蛋白量

A: 葉片; B: 莖鞘; C: 幼穗或糙米; BPC: Bt蛋白量。*和**: 差異達(dá)0.05和0.01概率顯著水平。

A: leaf blade; B: sheath-culm; C: young panicle or brown rice; BPC: Bt protein content. *, **: significant at< 0.05 and< 0.01, respectively.

2.2 不同生長發(fā)育階段Bt蛋白量

從圖3可見, 葉片和莖鞘的Bt蛋白量, 除轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1葉片從分蘗期、抽穗期到灌漿期有逐漸上升趨勢之外, HD1和HD2不同生長發(fā)育階段高低明顯不同, 通常情況是分蘗期最低、抽穗期居中、灌漿期最高。幼穗或糙米Bt蛋白量, 不論HD1還是HD2, 不同生長發(fā)育階段高低差異顯著, 抽穗期幼穗比灌漿期幼穗高, 最低的是成熟糙米。這說明, 隨著生長發(fā)育進(jìn)程葉片及莖鞘等營養(yǎng)器官Bt蛋白量升高; 幼穗及糙米等生殖器官Bt蛋白量降低。

圖3 轉(zhuǎn)基因早粳稻不同生長發(fā)育階段的Bt蛋白量

A: 葉片; B: 莖鞘; C: 幼穗或糙米; BPC: Bt蛋白量。*和**: 差異達(dá)0.05和0.01概率顯著水平。

A: leaf blade; B: sheath-culm; C: young panicle or brown rice; BPC: Bt protein content. *, **: significant at< 0.05 and< 0.01, respectively.

2.3 不同器官Bt蛋白量

圖4顯示, 轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1和HD2的葉片、莖鞘、幼穗或糙米等不同器官間Bt蛋白量差異極顯著, 在分蘗期、抽穗期和灌漿期等各生長發(fā)育階段, Bt含量最高的器官均為葉片, 其次為莖鞘及幼穗, 糙米Bt蛋白量最低。轉(zhuǎn)基因早粳稻, 目的基因表達(dá)蛋白高低次序為葉片、莖鞘及幼穗、糙米。

圖4 轉(zhuǎn)基因早粳稻器官的Bt蛋白量

A: 分蘗期; B: 抽穗期; C: 灌漿期及成熟期; BPC: Bt蛋白量。**差異達(dá)0.01概率顯著水平。

A: tillering stage; B: heading stage; C: filling stage and maturity; BPC: Bt protein content. **: significant at< 0.01.

2.4 不同品系抽穗期各器官及成熟期糙米Bt蛋白量與螟蟲抗性

室內(nèi)抗蟲性實驗結(jié)果顯示對照CK水稻品種空育131的3個重復(fù)二化螟幼蟲死亡率均在5%以下, 分別為3.33%、6.67%和3.33%, 平均為4.44%± 1.93%。同時, 轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1及HD2各品系二化螟幼蟲死亡率均在90%以上, 且未死亡幼蟲表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、生長緩慢的特征(數(shù)據(jù)未在本文提供)。說明室內(nèi)抗蟲性實驗可以有效地鑒定區(qū)分水稻抗螟蟲性。

由表1可知, 轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1不同品系, 抽穗期葉片、莖鞘和幼穗Bt蛋白量、成熟期糙米Bt蛋白量、以及螟蟲抗性強(qiáng)弱等差異極顯著。與HD1情況類似, 抽穗期各器官Bt蛋白量、糙米Bt蛋白量、螟蟲抗性等在HD2不同品系間存在顯著或極顯著差異。

表1 轉(zhuǎn)基因早粳稻不同品系Bt蛋白量及抗蟲性

**表示轉(zhuǎn)基因早粳稻品系間差異達(dá)0.01概率顯著水平。

BPC: Bt protein content;**: significant at< 0.01 among transgenic earlyrice lines.

轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1不同品系間抽穗期葉片、莖鞘及幼穗Bt蛋白量與校正二化螟幼蟲死亡率間相關(guān)性未達(dá)到顯著水平, 葉片、莖鞘及幼穗等器官目的基因蛋白表達(dá)量高低與螟蟲抗性強(qiáng)弱沒有關(guān)系(表2)。HD2不同品系抽穗期葉片、莖鞘及幼穗Bt蛋白量與校正幼蟲死亡率存在顯著正相關(guān)或正相關(guān)趨勢(表2)。結(jié)合表1, HD1和HD2品系校正幼蟲死亡率均在90%以上, 表現(xiàn)出高抗螟蟲。這表明, 在本研究范圍內(nèi), 目的基因及其表達(dá)框完全可以滿足培育轉(zhuǎn)基因早粳稻品種的要求。

表2還顯示, HD1和HD2轉(zhuǎn)基因早粳稻抽穗期植株各器官Bt蛋白量與糙米Bt蛋白量間相關(guān)不顯著, 生長發(fā)育階段水稻植株外源Bt蛋白表達(dá)量與糙米中Bt蛋白量沒有必然聯(lián)系。在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲早粳稻品種工作中, 在定性地鑒定選擇Bt蛋白存在同時, 更多的精力可以集中于農(nóng)藝性狀的鑒定選擇。

表2 轉(zhuǎn)基因早粳稻不同品系抽穗期Bt蛋白量和糙米Bt蛋白量及螟蟲抗性關(guān)系

*表示轉(zhuǎn)基因早粳稻器官間相關(guān)性達(dá)0.05概率顯著水平。

BPC: Bt protein content;*: significant at< 0.05 interorgan correlation in among transgenic earlyrice.

3 討論

迄今為止, 序列已知及命名的Cry毒素蛋白有300多種。根據(jù)氨基酸序列同一性程度, 把Cry毒素分為74個一級類別((Cry1~Cry74)[27-28]。轉(zhuǎn)早粳稻HD1與轉(zhuǎn)早粳稻HD2, 受體品種均為空育131水稻, 用于遺傳轉(zhuǎn)化的Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)差異僅在于基因的不同。HD1或HD2不同品系, Bt蛋白表達(dá)量高低不同。不過, 在田間整個生長期的各 個器官, HD1所有品系Bt蛋白量均極顯著地低于HD2各品系。不同基因在植物細(xì)胞蛋白質(zhì)層面的表達(dá)量(或最高表達(dá)量)應(yīng)該是有差別的。植物細(xì)胞內(nèi)基因蛋白質(zhì)表達(dá)量低于基因, 至少在轉(zhuǎn)早粳稻和轉(zhuǎn)早粳稻中的情況是這樣的。

植物的目的基因蛋白表達(dá)量在不同生長發(fā)育階段是不同的。棉花田間生長過程中同一組織的Bt蛋白質(zhì)含量呈動態(tài)下降趨勢[29],玉米隨生育期的延長Bt蛋白的表達(dá)量降低[30-32]。在本研究中, 轉(zhuǎn)或基因早粳稻的幼穗或糙米的Bt蛋白量隨生長發(fā)育的推進(jìn)而降低, 但是, 葉片及莖鞘的Bt蛋白量隨生長發(fā)育的推進(jìn)而升高。本研究Bt蛋白量檢測是以樣品鮮重為基礎(chǔ)的, 葉片及莖鞘等營養(yǎng)器官生長發(fā)育前期含水量比生長發(fā)育后期含水量要高得多, 這可能是轉(zhuǎn)基因早粳稻營養(yǎng)器官Bt蛋白量生長發(fā)育前期低、后期高的原因之一。

植物的目的基因蛋白表達(dá)量在不同器官是不同的。玉米[31]、水稻[33-35]等作物葉片中Bt蛋白表達(dá)量總是高于其他器官。但是,大豆葉片Bt蛋白表達(dá)量低于莖及根, 是營養(yǎng)器官中Bt蛋白量最低的[36]。本研究結(jié)果顯示, 不論轉(zhuǎn)還是轉(zhuǎn)基因早粳稻, 生殖器官Bt蛋白量都低于營養(yǎng)器官, 營養(yǎng)器官中葉片Bt蛋白量最高。這說明, 以淀粉為主要儲存物質(zhì)的玉米和水稻等作物, 組成型啟動子調(diào)控下的外源基因在“源器官”葉片表達(dá)量高于“庫器官”穗及稻谷中的表達(dá)。谷蛋白是水稻糙米中最重要的儲存蛋白, 稻谷中貯藏蛋白基因的表達(dá)通常具有組織與時空特異性及特定的靶向元件[37-38]。等組成型啟動子調(diào)控下的或基因在穗及糙米等器官中Bt蛋白量低是有分子依據(jù)的。

在棉花中, Bt蛋白含量與棉鈴蟲幼蟲死亡率呈正相關(guān), 含量越高, 抗蟲性越好[25]。玉米與棉花類似, Bt蛋白的表達(dá)量與玉米對亞洲玉米螟抗性呈正相關(guān)[32]。本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因早粳稻HD1各器官Bt蛋白量和螟蟲抗性沒有關(guān)系, 轉(zhuǎn)基因早粳稻HD2各器官Bt蛋白量和螟蟲抗性雖有正相關(guān)趨勢, 但是沒有達(dá)到顯著水平。同時, HD1品系和HD2品系均高抗螟蟲。其原因可能在于, 本研究所使用的抗蟲基因是針對水稻密碼子偏愛性進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的基因, 其啟動子是單子葉植物細(xì)胞高效啟動子ubi, 該基因及其表達(dá)框在水稻細(xì)胞中的表達(dá)量完全可以達(dá)到抗蟲育種的要求。

轉(zhuǎn)基因植物即使外源基因是單拷貝的、插入位點是基因間區(qū)的轉(zhuǎn)化事件形成的品種(品系), 由于外源基因表達(dá)消耗能量, 往往導(dǎo)致受體品種農(nóng)藝性狀的變劣[39-40]。在沒有害蟲脅迫條件下, 轉(zhuǎn)基因秈稻明恢63 ()和轉(zhuǎn)基因明恢63 ()比明恢63產(chǎn)量降低, 明恢63 ()比明恢()Bt蛋白量低, 但減產(chǎn)幅度更大[41-42]。本研究結(jié)果顯示在早粳稻細(xì)胞中2A*基因比1C*基因蛋白表達(dá)量高, 暗示外源基因引進(jìn)植物細(xì)胞及增加了細(xì)胞能量負(fù)擔(dān), 導(dǎo)致農(nóng)藝性狀變劣不是必然的。如果增加遺傳轉(zhuǎn)化事件, 擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因育種群體及田間鑒定選擇壓力, 應(yīng)該能夠培育出具有外源目標(biāo)性狀、同時農(nóng)藝性狀與受體品種類似或相同的純系。不同Cry蛋白殺蟲譜不同[43]。對同一靶標(biāo)幼蟲, Cry2A與靶標(biāo)昆蟲幼蟲腸道細(xì)胞受體結(jié)合位點與Cry1C及Vip3A也不同[28,43]。培育高抗螟蟲、農(nóng)藝性狀與空育131水稻類似的HD1及HD2, 在生產(chǎn)上混合或輪換應(yīng)用HD1和HD2, 把與結(jié)合起來用于轉(zhuǎn)基因早粳稻品種, 理論上可以推遲黑龍江省水稻二化螟對Bt蛋白抗性的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

以早粳稻空育 131為受體, 遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)制了早粳稻空育131 ()和空育131 ()等轉(zhuǎn)基因早粳稻。其葉片、莖鞘、幼穗和糙米中的Cry2A蛋白量在各生長發(fā)育階段均極顯著高于Cry1C表達(dá)量。葉片及莖鞘等營養(yǎng)器官Bt蛋白量隨生長發(fā)育動態(tài)而增加, 幼穗或糙米等生殖器官Bt蛋白量在生長發(fā)育早期較高、晚期較低。Bt蛋白量在葉片中最高、莖鞘及幼穗中較低、糙米中最低。同一抗蟲基因不同轉(zhuǎn)基因品系間抽穗期各器官Bt蛋白量與室內(nèi)抗螟蟲性及成熟期糙米Bt蛋白量之間未見相關(guān)性, 本研究所使用的基因及其表達(dá)框可以滿足培育抗蟲轉(zhuǎn)基因早粳稻品種的要求。

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Spatio-temporal Expression of Bt Protein and Stem Borer Resistance of Transgenic EarlyRice withorGene

LI Rong-Tian1, WANG Xin-Yu1, TIAN Chong-Bing1, ZHOU Qing1, and LIU Chang-Hua1,2,*

1Key Laboratory of Molecular Biology, College of Heilongjiang Province / Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China;2College of Agricultural Resources and Environment, Heilongjiang University, Harbin 150080, Heilongjiang, China

The earlyrice Kongyu 131 () was transformed withorgene driven bypromoter usingmediated method to create the transgenic earlyrice Kongyu 131 () and Kongyu 131 (). The experiments were conducted by transplanting the different lines of Kongyu 131 () and Kongyu 131 () from independent transformation events in the field to detect Bt protein content (BPC) of organs of the transgenic rice at different growth stages with enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA) and resistance to rice striped stem borer as evidenced by insect feeding bioassays. The BPC ofgene was always lower than that ofin earlyrice. There was a difference in BPC at different growth stages of transgenic rice, displaying tillering stage < heading stage < filling stage in leaf blade or sheath-stem and heading stage > filling stage > maturity in young panicle or brown rice. BPC of organs of transgenic rice was different at every stage, the order of BPC from high to low was leaf blade and sheath-stem at tillering stage, leaf blade, young panicle and sheath-stem at heading stage, leaf blade, sheath-stem, young panicle and brown rice at filling stage and maturity. There were some obvious differences in BPC of leaf blade, sheath-stem and young panicle at heading stage or brown rice at maturity and in borer-resistant property among transgenic lines withor. Correlations between BPC of each organ at heading stage and borer-resistant property or BPC of brown rice were not found in transgenic rice lines withor. The BPC increased in vegetative organs while descended in reproductive organs in the process of growth and development, and BPC of vegetative organs was usually higher than BPC of reproductive organs in both of Kongyu 131 () and Kongyu 131 (). All transgenic earlyrice showed effective resistance to stem borer in the experiment, though there was significant difference in BPC either betweenandgenes or among transgenic rice lines.

gene;gene; transgenic earlyrice; Bt protein content; spatio-temporal expression; stem borer resistance

2018-01-23;

2018-08-20;

2018-09-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.01829

通信作者(Corresponding author): 劉長華, E-mail: liuchanghua70@163.com, Tel: 0451-86609487

E-mail: lirongtian07@aliyun.com, Tel: 0451-86608243

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08001001-001-007), 國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863 計劃)項目(2014AA10A600)和分子生物學(xué)黑龍江省高校重點實驗室開放課題(1206)資助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08001001-001-007), the National Major Project for Developing New GM Crops (2014AA10A600), and the Open Project of Key Laboratory of Molecular Biology, College of Heilongjiang Province.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180927.0953.004.html