甘藍(lán)型油菜蕓薹素唑耐受因子(BnaBZR1/BnaBES1)全長(zhǎng)CDS克隆與生物信息學(xué)分析

馮 韜 官春云

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甘藍(lán)型油菜蕓薹素唑耐受因子(BnaBZR1/BnaBES1)全長(zhǎng)CDS克隆與生物信息學(xué)分析

馮 韜 官春云*

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 國(guó)家油料改良中心湖南分中心, 湖南長(zhǎng)沙 410128

蕓薹素唑耐受因子(brassinazole-resistant, BZR)是油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子, 目前已知BZR1與BZR2 (BES1)兩種亞型。本文在甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)cDNA中克隆到3個(gè)全長(zhǎng)編碼序列(coding sequence, CDS), 經(jīng)比對(duì)鑒定分別為定位于A07染色體的1拷貝BZR1和定位于A06染色體的2拷貝BES1, 分別命名為、和, 序列長(zhǎng)分別為996、993和996 bp, 各自編碼331、330、331個(gè)氨基酸。這3個(gè)基因編碼蛋白具有典型植物BZR/BES結(jié)構(gòu)域, 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)主要位于細(xì)胞核。多序列比對(duì)和進(jìn)化分析表明,基因編碼蛋白與甘藍(lán)、白菜、擬南芥、亞麻芥等BZR/BES蛋白具有較高的同源性, 且同源物種間BZR1或BES1相似度高于同一物種或者近緣物種中BZR1與BES1間相似度, 表明BZR1與BES1分化是一個(gè)早期進(jìn)化事件。湘油15號(hào)中這3個(gè)基因表達(dá)規(guī)律相似, 苗期和花期具有高水平的基因表達(dá), 抽薹期和角果成熟期表達(dá)稍低; 且基因表達(dá)水平在地上部分的葉、莖、花和角果中相對(duì)于地下部分的根中較高。

甘藍(lán)型油菜; 蕓薹素唑耐受因子; 基因克隆; 基因表達(dá); 生物信息學(xué)分析

油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑是植物中重要的激素途徑, 其活性調(diào)控與植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆能力息息相關(guān)。蕓薹素唑耐受因子BZR是油菜素內(nèi)酯信號(hào)與其他信號(hào)互作的核心元件, 在油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中BZR1/BES1復(fù)合體與PIF4和DELLA等轉(zhuǎn)錄因子互作, 分別介導(dǎo)油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑與光信號(hào)[1]、赤霉素信號(hào)[2]、茉莉酸信號(hào)[3]等互作。在擬南芥中, AtBZR1與AtBES1形成異源復(fù)合體并相互磷酸化, 磷酸化后的異源二聚體與AtPIF4結(jié)合, 形成三元復(fù)合物介導(dǎo)下游基因表達(dá)調(diào)控, 從而完成油菜素內(nèi)酯信號(hào)與光信號(hào)之間的傳遞, AtBZR1/AtBES1通過(guò)磷酸化修飾結(jié)合DELLA蛋白, 從而影響赤霉素的生物合成與赤霉素信號(hào)通路產(chǎn)生互作[4]。

擬南芥[5]、水稻[6]等植物中油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑的研究比較深入, 不僅完成了信號(hào)途徑中主要基因的克隆, 而且對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、傳遞有了較全面的認(rèn)識(shí)。擬南芥和水稻中油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程基本一致, 油菜素內(nèi)酯(BRs)結(jié)合膜表面受體BRI1激活其激酶活性, 并誘導(dǎo)BRI1結(jié)合BAK1形成二聚體后相互磷酸化, BSKs蛋白通過(guò)活化的BRI1磷酸化其230位絲氨酸而激活, 活化的BSKs蛋白激活BSU1活性, 進(jìn)而BSU1阻斷BIN2對(duì)BZR/BES蛋白的過(guò)磷酸化, 去磷酸化的BZR/BES蛋白在細(xì)胞核積累并與PIF4和DELLA等轉(zhuǎn)錄因子互作, 同時(shí)參與下游靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

有研究表明, 油菜素內(nèi)酯可以促進(jìn)油菜對(duì)高鹽環(huán)境耐受性, 調(diào)節(jié)油菜真菌抗性, 影響油菜脂代謝。油菜素內(nèi)酯處理可明顯改善油菜幼苗對(duì)滲透脅迫的抗性[7], 2,4-表油菜素內(nèi)酯可增強(qiáng)油菜對(duì)丁香假單胞菌的抗性[8], 同時(shí)2,4-表油菜素內(nèi)酯影響油菜脂代謝, 調(diào)控酯質(zhì)信號(hào)的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。過(guò)表達(dá)油菜素內(nèi)酯合成基因可以促進(jìn)油菜提高產(chǎn)量[10], 表明油菜素內(nèi)酯與甘藍(lán)型油菜生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān), 油菜素內(nèi)酯在油菜生產(chǎn)上有廣闊的應(yīng)用前景。然而甘藍(lán)型油菜中油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑的相關(guān)研究卻比較薄弱, 信號(hào)通路的構(gòu)成元件大部分都還處于未知狀態(tài), 嚴(yán)重制約了油菜素內(nèi)酯信號(hào)相關(guān)基因篩選在高含油、高抗性油菜新品種選育過(guò)程中的作用, 限制了油菜分子育種中相關(guān)基因工程的應(yīng)用, 同時(shí)由于理論研究的空白限制了油菜素內(nèi)酯在油菜生產(chǎn)上的應(yīng)用。

本文通過(guò)甘藍(lán)型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的基因序列設(shè)計(jì)引物, 從甘藍(lán)型油菜品種湘油15號(hào)中克隆獲得3個(gè)基因CDS序列, 一個(gè)鑒定為BZR1型, 2個(gè)鑒定為BES型, 均位于A染色體組。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜雙低品系湘油15號(hào)由國(guó)家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 RNA提取與cDNA合成

將湘油15號(hào)在22℃、光周期為16 h/8 h條件下培養(yǎng)至2片真葉, 取幼苗50~100 mg。加液氮充分研磨后, 使用TRIzol RNA提取試劑盒(TransGen生物技術(shù)有限公司)按其所示方法提取總RNA, 以此RNA為模板參照Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(TransGen生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書合成第1鏈cDNA。

1.3 BnaBZR基因的克隆及序列分析

從BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad/)甘藍(lán)型油菜全轉(zhuǎn)錄組中提取以及的轉(zhuǎn)錄本序列。分析比對(duì), 設(shè)計(jì)含起始密碼子的5'端引物和含有終止密碼子的3'端引物, 合成備用。設(shè)計(jì)的引物序列為BnaBZR1-F: 5'-ATGACGTCAGA TGGAGCTAC-3', BnaBZR1-R: 5'-TCAACCACGAG CTTTGCCG-3', BnaBES1-F: 5'-ATGACGTCTGACG GTGCG-3', BnaBES1-R: 5'-CTAACGACCTTTAGCG TTTCC-3'。以1.2所述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系含50 ng μL–1模板1 μL、10 mmol L–1dNTPs 0.5 μL、2 μmol L–1BnaBZR1-F 0.75 μL、2 μmol L–1BnaBZR1-R 0.75 μL、10×反應(yīng)緩沖液1 μL、HiFi高保真DNA聚合酶0.5 μL和ddH2O 15.5 μL。程序?yàn)轭A(yù)變性95℃ 5 min; 95℃ 50 s, 58℃ 45 s, 72℃ 3 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測(cè)和記錄結(jié)果。將PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體(TransGen生物技術(shù)有限公司)連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 (北京天根生化有限公司), 篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行基因測(cè)序, 通過(guò)BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad/)對(duì)獲得的克隆序列進(jìn)行染色體步移分析, 隨后使用DNAman對(duì)克隆獲得的和基因全長(zhǎng)CDS序列進(jìn)行序列比對(duì)。通過(guò)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/)下載甘藍(lán)型油菜BZR相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本序列及植物BZR相關(guān)蛋白, 構(gòu)建HMM文件, 使用HMMER軟件檢索甘藍(lán)型油菜預(yù)測(cè)蛋白組, 并就BZR相關(guān)轉(zhuǎn)錄本在甘藍(lán)型油菜基因組中的分布進(jìn)行分析。

1.4 BnaBZR蛋白生物信息學(xué)分析

1.4.1 BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_ A06R氨基酸序列特征與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)ANTHEPROT 6.2軟件分析來(lái)源于甘藍(lán)型油菜的BnaBZR1和BnaBES1基因所編碼的蛋白質(zhì)。統(tǒng)計(jì)編碼蛋白的氨基酸殘基組分、分析編碼蛋白的等電點(diǎn)、信號(hào)肽序列和親疏水特征并使用Gariner模型進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。使用PSORT (http://psort.hgc.jp/form. html)和Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/ cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4.2 BnaBZR蛋白同源結(jié)構(gòu)域分析 使用DNAman對(duì)BnaBZR蛋白進(jìn)行同源比對(duì)分析; 同時(shí)使用NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分別對(duì)不同的BnaBZR蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析; 使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)、MOTIF (http://www. genome.jp/tools/motif/)及InterPro (http://www.ebi.ac. uk/interpro/)分析BnaBZR包含的特殊結(jié)構(gòu)域。

1.4.3 BZR蛋白聚類分析 通過(guò)NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)、String數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string.embl.de/)和PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. pdb.org/pdb/home/home.do)檢索來(lái)源于不同物種的BZR相關(guān)蛋白序列, 并使用MEGA6.0對(duì)來(lái)源不同的BZR1相關(guān)蛋白進(jìn)行聚類分析。

1.5 甘藍(lán)型油菜中BnaBZR1_A07、BnaBES1_ A06F和BnaBES1_A06R基因時(shí)空表達(dá)分析

以1.2方法提取甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)不同時(shí)期根、莖、葉、花和角果皮總RNA, 使用寶生物工程(大連)有限公司PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 獲得cDNA第1鏈作為qRT-PCR模板。分析1.3中克隆獲得的片段, 根據(jù)序列特征設(shè)計(jì)分型引物, 以作為內(nèi)參基因[11], 用于和時(shí)空表達(dá)分析, 每樣品進(jìn)行3次重復(fù)。QRT-PCR在ABI 7500熒光定量PCR系統(tǒng)上運(yùn)行。PCR體系包含1 μL cDNA、10 μL 2×FastStart Universal SYBR GreenMaster with ROX、10 μmol L–1正向引物和反向引物各0.5 μL、8 μL ddH2O。PCR程序?yàn)?5℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 72℃ 32 s, 35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后進(jìn)行95℃ 20 s, 60℃ 20 s, 95℃ 20 s, 59℃ 20 s繪制熔解曲線檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性和引物二聚體。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnaBZR基因全長(zhǎng)CDS序列的克隆

以湘油15 cDNA為模板, 克隆到3個(gè)CDS序列, 長(zhǎng)度分別為996、993和996 bp (圖1), 分別定位于A07、A06和A06染色體上, 分別命名為、和。通過(guò)BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 確認(rèn)3個(gè)CDS序列的完整性, 以3條CDS序列為模板分別對(duì)BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索, 發(fā)現(xiàn)1條同源序列位于C06染色體, 相似度82.5%, 發(fā)現(xiàn)1條和共有同源序列位于C08染色體, 相似度分別為85.2%和84.9%; 同時(shí)對(duì)、和進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),與和相似度分別為82.28%和82.26%,和相似度98.79%。以上結(jié)果表明, 克隆獲得的與和分屬2個(gè)不同的家族亞類群, 并在C亞基因組上存在對(duì)應(yīng)的同源基因; 甘藍(lán)型油菜基因組具異源多倍性, 其A、C兩個(gè)亞基因組之間高度同源, 在A染色體組上的基因大多存在C染色體組同源基因, C染色體組基因亦然。

圖1 BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R 基因克隆

M: 2K DNA marker; 1:編碼序列; 2:編碼序列; 3:編碼序列。

M: 2K DNA marker; 1:CDS; 2:CDS; 3:CDS.

從NCBI共獲取甘藍(lán)型油菜BZR/BES及BZR/BES類似序列轉(zhuǎn)錄本13個(gè), 7個(gè)位于C染色體組, 6個(gè)位于A染色體組, 主要集中于A06、A07、A08、C06、C08和C09染色體; HMMER檢索甘藍(lán)型油菜預(yù)測(cè)蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)共發(fā)現(xiàn)31條具有BZR/BES家族特征結(jié)構(gòu)域的序列, 其中17個(gè)位于A染色體組, 14個(gè)位于C染色體組; 表明具有特征的基因在甘藍(lán)型油菜A/C基因組間分布較均勻, 具有特征的家族基因在甘藍(lán)和白菜2個(gè)亞組間可能具有相似的進(jìn)化規(guī)律。

2.2 BnaBZR生物信息學(xué)分析

和基因各自編碼長(zhǎng)度331、330和331個(gè)氨基酸殘基的蛋白, 分別命名為BnaBZR1_A07、BnaBES1_ A06F和BnaBES1_A06R (表1)。

表1 BnaBZR1、BnaBES1_F和BnaBES1_R蛋白信息匯總表

BnaBZR蛋白主要表現(xiàn)疏水性, 未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列, 暗示其不存在信號(hào)肽介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。PSORT與Plant–mPLoc亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示, BnaBZR1_A07與BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06 R 均主要定位于細(xì)胞核, 可信度0.789, 這與BZR蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的功能一致。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2, BnaBZR1_A07有27% α螺旋、14% β折疊、29% β轉(zhuǎn)角和32%無(wú)規(guī)卷曲; BnaBES1_A06F分別有24%、16%、29%和31%; BnaBES1_A06R分別有23%、16%、29%和32%。

圖2 BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

通過(guò)ANTHEPROT分析了BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R蛋白具有的序列特異性識(shí)別位點(diǎn)。由表2可知, BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R具有僅含微弱差別的特異性識(shí)別序列, BnaBES1_A06R相對(duì)于BnaBES1_A06F僅175– 177位置識(shí)別序列存在一個(gè)氨基酸殘基的差別, 其他位置的特異性識(shí)別序列完全一致, 表明BnaBES1_ A06F和BnaBES1_A06R蛋白相似度極高。BnaBZR1_A07蛋白缺少PS00016特異性序列, 同時(shí)PS00006特異性序列數(shù)量也更少。3條蛋白序列中特異性識(shí)別序列主要為糖基化修飾、磷酸化修飾、酰化修飾和細(xì)胞連接序列, 表明BnaBZR蛋白可能受多種激酶介導(dǎo)的糖基化、磷酸化、?；揎椪{(diào)節(jié), 并可能介導(dǎo)細(xì)胞間連接, 這與擬南芥BZR蛋白通過(guò)磷酸化水平改變實(shí)現(xiàn)核質(zhì)穿梭與互作因子結(jié)合, 調(diào)控下游靶基因表達(dá)的功能相吻合。

表2 BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R蛋白特殊識(shí)別位點(diǎn)序列總表

（續(xù)表2）

蛋白編號(hào)Serial number位點(diǎn)類型Domains type數(shù)量Number位置Location序列Sequence序列模式Sequence motif BnaBES1_A06RPS00005518–20, 23–25, 83–85, 99–101, 174–176TRR, SWR, TYR, SSR, TNK[ST]-x-[RK] PS00006623–26, 112–115, 134 –137, 227 –230, 237–240, 305–308SWRE, SPFE, SRGD, TIPE, STVD, TPWE[ST]-x(2)-[DE] PS0000855–10, 149–154, 150–155, 259–264, 325–330GATSTS, GGIPSS, GIPSSL, GVSSAV, GNAKGRG-{EDRKHPFYW}-x(2)-[STAGCN]-{P} PS000161135–137RGDR-G-D PS000011139–142NISTN-{P}-[ST]-{P} PS00004121–24RKPS[RK](2)-x-[ST] PS00005518–20, 24–26, 84–86, 100–102, 175–177TRR, SWR, TYR, SSR, TSK[ST]-x-[RK] PS00006624–27, 113–116, 135–138, 228–231, 238–241, 306–309SWRE, SPFE, SRGD, TIPE, STVD, TPWE[ST]-x(2)-[DE] PS0000855–10, 150–155, 151–156, 260–265, 326–331GATSTS, GGIPSS, GIPSSL, GVSSAV, GNAKGRG-{EDRKHPFYW}-x(2)-[STAGCN]-{P} PS000161136–138RGDR-G-D

PS00001: 糖基化位點(diǎn); PS00004: cAMP/GMP 依賴激酶磷酸化位點(diǎn); PS00005: 蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn); PS00006: 酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn); PS00008: 豆蔻?；稽c(diǎn); PS00016: 細(xì)胞粘連序列。

PS00001: N-glycosylation site; PS00004: cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site; PS00005: Protein kinase C phosphorylation site; PS00006: Casein kinase II phosphorylation site; PS00008: N-myristoylation site; PS00016: Cell attachment sequence.

同源比對(duì)BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R, 同時(shí)使用SMART和MOTIF分析結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn), 3條BnaBZR蛋白具有基本相同的結(jié)構(gòu)域, N端表現(xiàn)明顯的植物BZR/BES結(jié)構(gòu)特征序列, C端結(jié)構(gòu)差異相對(duì)明顯; 全長(zhǎng)蛋白序列與pfam05687、PLN02905、cd00609等結(jié)構(gòu)域相似度高, 3條蛋白序列中均存在多個(gè)激酶特征域, 可能參與磷酸化、酰基化, 蛋白本身又具豐富的磷酸化位點(diǎn), 這與BZR/BES蛋白可以通過(guò)結(jié)合并相互磷酸化進(jìn)行構(gòu)象調(diào)控介導(dǎo)核質(zhì)穿梭的功能一致(圖3)。

通過(guò)不同數(shù)據(jù)庫(kù), 共獲得70種來(lái)源于不同植物的BZR相關(guān)蛋白序列, 使用MEGA6.0進(jìn)行聚類分析, 繪制進(jìn)化樹(圖4)。

BZR/BES相關(guān)蛋白聚類表現(xiàn)出了明顯單、雙子葉植物差異, 十字花科植物BZR/BES蛋白明顯聚于同一亞群。對(duì)十字花科BZR/BES相關(guān)蛋白亞群分析可以發(fā)現(xiàn), BZR1及其相似蛋白明顯聚類, BZR2與其相似蛋白明顯聚類, 蛋白類別之間的差異遠(yuǎn)大于物種差異, 同一亞類蛋白在不同的十字花科植物中相似度極高, 分枝距離極近, 然而, 甚至在同一物種中BZR1與BZR2亞群的分枝距離都較遠(yuǎn), 相似度相對(duì)較低, 表明BZR1與BZR2的分化是一個(gè)早期進(jìn)化事件。但物種親緣關(guān)系極遠(yuǎn)的單雙子葉植物中BZR/BES蛋白同樣具有較高的相似度, 較近的親緣關(guān)系, 表明BZR/BES蛋白家族在進(jìn)化中起源古老且高度保守, 側(cè)面顯示BZR/BES家族蛋白可能具有能影響植物生存的重要作用。

2.3 甘藍(lán)型油菜中BnaBZR1時(shí)空表達(dá)特征

為進(jìn)一步了解在甘藍(lán)型油菜中的功能, 對(duì)甘藍(lán)型油菜不同時(shí)期, 不同組織中、和表達(dá)進(jìn)行了分析, 三基因定量引物為 BZR1_A07-F: 5'-CTCTC ATCTCCAACTTCCAA-3', BZR_A07-R: 5'-GACTC ATCACACTCAGGTAT-3'; BES1_A06F-F: 5'-TTCTC CGACCTTCAACCTA-3', BES1_A06F-R: 5'-TCCTC CATAGCCACATCAT-3￠; BES1_A06R-F: 5'-GGCTACTATACCTGAATGTGA-3', BES1_A06R-R: 5'-GCT GTTGCTGTTGTGAGA-3'; 內(nèi)參引物為BnUBC21- F: 5'-CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT-3', BnUBC21-R: 5'-TATCTCCCCTGTCTTGAAATGC-3'。

圖3 BnaBZR氨基酸序列比對(duì)

由圖5可知, 湘油15號(hào)中、和具有相似的表達(dá)模式, 基因表達(dá)均表現(xiàn)一定的組織差異和一定的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間差異, 在莖葉花果等地上部分表達(dá)比地下部分高, 苗期、花期表達(dá)比抽薹期和角果成熟期高。在湘油15號(hào)根中的表達(dá)在各個(gè)生育時(shí)期均相對(duì)較低且平穩(wěn), 在莖葉中表達(dá)水平較高, 但在角果成熟過(guò)程中莖葉中表達(dá)水平顯著下降, 同時(shí)在花中可以發(fā)現(xiàn)高水平的表達(dá)。在湘油15號(hào)中相對(duì)于整體表現(xiàn)較低表達(dá)水平, 莖葉與根中表達(dá)水平的差異相對(duì)較小。在花期和表達(dá)水平達(dá)到峰值, 根中表達(dá)水平隨發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)較明顯的差異。植物各組織均有油菜素內(nèi)酯合成能力, 但地上部分組織中油菜素內(nèi)酯含量高于地下部分, 尤其是花、種子和嫩葉中含量較高,、和在甘藍(lán)型油菜中表現(xiàn)的組織差異與此具有相似規(guī)律, 這也與油菜素內(nèi)酯一方面能通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)BZR/BES活化, 同時(shí)BZR/BES又能對(duì)油菜素內(nèi)酯生物合成形成負(fù)反饋的規(guī)律吻合, 這一定程度上表明甘藍(lán)型油菜中、和與油菜素內(nèi)酯信號(hào)具有緊密的關(guān)聯(lián)性。

3 討論

湘油15號(hào)是我國(guó)第一個(gè)通過(guò)國(guó)家審定并大面積推廣的雙低油菜品種, 是油菜育種中應(yīng)用非常廣泛的重要種質(zhì)資源, 但湘油15號(hào)未經(jīng)重測(cè)序, 大量基因并未被克隆和研究, 一定程度上制約了種質(zhì)資源的有效利用。本文從甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)中克隆獲得3個(gè)基因拷貝, 測(cè)序比對(duì)顯示與油菜基因組測(cè)序品種中雙11中序列一致, 各自編碼的BnaBZR蛋白的生物信息學(xué)分析顯示其具有典型的植物BZR/BES功能結(jié)構(gòu)域, 亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核, 具有多重轉(zhuǎn)錄因子功能的核心元件序列, 存在大量磷酸化, 酰基化功能位點(diǎn), 且本身具有磷酸化酶活性域, 表明基因是重要的涉及磷酸化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子, 這與擬南芥[11]、水稻[12]等植物中BZR1/BES1通過(guò)形成復(fù)合體并相互磷酸化, 介導(dǎo)與PIF4、SMOS1等轉(zhuǎn)錄因子的互作, 并調(diào)控下游基因表達(dá)一致。

圖4 不同植物BZR/BES蛋白的進(jìn)化樹分析

圖5 不同發(fā)育時(shí)期不同組織中BnaBZR1_A07、BnaBES1_A06F和BnaBES1_A06R的表達(dá)量

DAG表示種子萌發(fā)后天數(shù)。DAG means days after seed germination.

聚類分析顯示, BZR/BES蛋白在進(jìn)化上具有較高的保守性, BnaBZR1_A07與白菜、甘藍(lán)、擬南芥等植物中BZR1及相似蛋白具有高度同源性, BnaBES1_A06F/R則與白菜、甘藍(lán)、擬南芥等植物中BZR2及相似蛋白高度同源, 同時(shí), 十字花科各近緣種中BZR1與BZR2間分枝距離相對(duì)較遠(yuǎn), 表明BZR1與BZR2的分化可能先于物種分化, 但進(jìn)化上又高度保守。另對(duì)甘藍(lán)型油菜BZR/BES相關(guān)基因染色體分布分析發(fā)現(xiàn)A、C亞基因組中BZR/BES出現(xiàn)較平衡, 這顯示了甘藍(lán)型油菜A、C亞基因組在進(jìn)化關(guān)系上仍然具有較高的同源性, 也間接證實(shí)“禹氏三角”中白菜與甘藍(lán)的近緣關(guān)系[13]。

油菜素內(nèi)酯途徑已在多種植物中被證明與植物抗病、種子形成等生物學(xué)過(guò)程關(guān)系密切[14], 油菜素內(nèi)酯在油菜[15]、水稻[16]、番茄[17]等多種作物中被證實(shí)可以用來(lái)提高抗逆性, 并有油菜素內(nèi)酯施用增加玉米[18]、番茄等茄科作物[19]產(chǎn)量的報(bào)告。因此闡明甘藍(lán)型油菜中油菜素內(nèi)酯信號(hào)的轉(zhuǎn)化、傳遞對(duì)油菜育種和生產(chǎn)具有重要意義。BZR/BES是油菜素內(nèi)酯信號(hào)與IAA、GA、光信號(hào)等多種信號(hào)途徑互作的節(jié)點(diǎn)[20], 是油菜素內(nèi)酯信號(hào)調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子, 對(duì)其克隆、表達(dá)研究對(duì)闡釋油菜素內(nèi)酯信號(hào)在油菜中的作用具有重要意義。本文克隆獲得3個(gè)全長(zhǎng)CDS, 分別定位在A07、A06、A06染色體上, 序列相似度較高, 這顯示基因起源較早且保守, 在原始的蕓薹屬植物中即已存在且具有重要功能。其中和同處在A06染色體端部相距不足10 kb的區(qū)域內(nèi)且二者序列相似性超過(guò)98%, 表明這很可能是一次基因重復(fù)造成。

對(duì)湘油15中、和表達(dá)研究顯示, 三者具有基本一致的表達(dá)規(guī)律, 表明基因在甘藍(lán)型油菜中可能具有相同或者相似的上游調(diào)控因子, 同時(shí)可能受到相同或者相似的環(huán)境因素、植物內(nèi)環(huán)境等影響。對(duì)甘藍(lán)型油菜中基因的表達(dá)調(diào)控、基因功能有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)cDNA中克隆到3個(gè)全長(zhǎng)編碼序列(coding sequence, CDS), 分別定位于A07、A06、A06號(hào)染色體, 分別命名為和。序列長(zhǎng)分別為996、993、996 bp, 各自編碼331、330和331個(gè)氨基酸。該基因編碼蛋白與其他植物BZR/ BES具有較高相似性, 具有典型的BZR/BES結(jié)構(gòu)域, 其起源較早, 但保守性較高。分析了和在湘油15號(hào)中的時(shí)空表達(dá)模式。

[1] Wang Z Y, Bai M Y, Oh E, Zhu J Y. Brassinosteroid signaling network and regulation of photomorphogenesis., 2012, 46: 701–724

[2] Gallego-Bartolomé J, Minguet E G, Grau-Enguix F, Abbas M, Locascio A, Thomas S G, Blázquez M A. Molecular mechanism for the interaction between gibberellin and brassinosteroid signaling pathways in., 2012, 109: 13446–13451

[3] Peleg Z, Blumwald E. Hormone balance and abiotic stress tole-rance in crop plants., 2011, 14: 290–295

[4] Wang W, Bai M Y, Wang Z Y. The brassinosteroid signaling network: a paradigm of signal integration., 2014, 21: 147–153

[5] Sun Y, Fan X Y, Cao D M, Tang W, He K, Zhu J Y, Patil S. Integration of brassinosteroid signal transduction with the transcription network for plant growth regulation in., 2010, 19: 765–777

[6] Tong H, Chu C. Brassinosteroid signaling and application in rice., 2012, 39: 3–9

[7] Efimova M V, Savchuk A L, Hasan J A K, Litvinovskaya R P, Khripach V A, Kholodova V P, Kuznetsov V V. Physiological mechanisms of enhancing salt tolerance of oilseed rape plants with brassinosteroids., 2014, 61: 733–743

[8] Skoczowski A, Janeczko A, Gullner G, Tóbias I, Kornas A, Barna B. Response of brassinosteroid-treated oilseed rape cotyledons to infection with the wild type and HR-mutant ofor with P. fluorescence., 2011, 104: 131–139

[9] Pokotylo I V, Kretynin S V, Khripach V A, Ruelland E, Blume Y B, Kravets V S. Influence of 24-epibrassinolide on lipid signalling and metabolism in., 2014, 73: 9–17

[10] Sahni S, Prasad B D, Liu Q, Grbic V, Sharpe A, Singh S P, Krishna P. Overexpression of the brassinosteroid biosynthetic geneinsimultaneously increases seed yield and stress tolerance., 2016, 6: 28298

[11] Lachowiec J, Mason G A, Schultz K, Queitsch C. Redundancy, feedback, and robustness in theBZR/BEH gene family., 2016: 053447

[12] Qiao S, Sun S, Wang L, Wu Z, Li C, Li X, Wang X. The RLA1/SMOS1 transcription factor functions with OsBZR1 to regulate brassinosteroid signaling and rice architecture., 2017, 29: 292–309

[13] Surhone L M, Timpledon M T, Marseken S F. Rapeseed. Germany: Betascript Publishing, 2010. pp 6–8

[14] Hao J, Yin Y, Fei S. Brassinosteroid signaling network: implications on yield and stress tolerance., 2013, 32: 1017–1030

[15] 李玲, 李俊, 張春雷, 張樹杰, 馬霓, 李光明. 外源 ABA 和 BR 在提高油菜幼苗耐漬性中的作用.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2012, 34: 489–495 Li L, Li J, Zhang C L, Zhang S J, Ma L, Li G M. Effects of exogenous ABA and BR on waterlogging resistance of juvenile rapeseed., 2012, 34: 489–495 (in Chinese with English abstract)

[16] Yang D L, Yang Y, He Z. Roles of plant hormones and their interplay in rice immunity., 2013, 6: 675–685

[17] Zheng Q, Liu J, Liu R, Wu H, Jiang C, Wang C, Guan Y. Temporal and spatial distributions of sodium and polyamines regulated by brassinosteroids in enhancing tomato salt resistance., 2016, 400: 147–164

[18] 王慶燕, 管大海, 潘海波, 李建民, 段留生, 張明才, 李召虎. 油菜素內(nèi)酯對(duì)春玉米灌漿期葉片光合功能與產(chǎn)量的調(diào)控效應(yīng).作物學(xué)報(bào), 2015, 41: 1557–1563 Wang Q Y, Guan D H, Pan H B, Li J M, Duan L S, Zhang M C, Li Z H. Effect of brassinolide on leaf photosynthetic function and yield in spring maize filling stage., 2015, 41: 1557–1563 (in Chinese with English abstract)

[19] Hayat S, Alyemeni M N, Hasan S A. Foliar spray of brassinoste-roid enhances yield and quality ofunder cadmium stress., 2012, 19: 325–335

[20] Fridman Y, Savaldi-Goldstein S. Brassinosteroids in growth control: how, when and where., 2013, 209: 24–31

Cloning and Characterization of Brassinazole-resistant (BnaBZR1 and BnaBES1) CDS fromL.

FENG Tao and GUAN Chun-Yun*

College of Agronomy, Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan, Changsha 410128, Hunan, China

Brassinazole-resistant (BZR) is a key transcription factor in brassinosteroid signaling pathway of plants, containing brassinazole-resistant 1 (BZR1) and brassinazole-resistant 2 (BES1). In this study, three novel BZR1 coding sequences (CDSs) were isolated from cDNA ofL. cv. Xiangyou 15 leaves, which were mapped on the chromosomes A07, A06, and A06, and designated as,, and, respectively. These threeCDSs were 996, 993, and 996 bp in length and encoded predicted proteins with 331, 330, and 331 amino acid residues, respectively. BnaBZR proteins were predicted to be located on the cell nucleus and have a typical plant BZR/BES conserved domain. Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of BnaBZR were highly homologous to previously reported BZR/BES of,, and. And the similarity of BZR1 or BES1 among different related species was higher than the similarity between BZR1 and BES1 in the same species or related species, indicating that BZR1 and BES1 differentiation is an early evolutionary event. The expression patterns of,, andin Xiangyou 15 were similar, whit high expression level at the seedling stage and flowering stage, while slightly lower level at the stage of bolting and podgrain ripening. The expression level ofin the aerial parts such as leaves, stems, flowers and pods was higher than that in underground parts.

L.; BZR; gene clone; gene expression; bionformatic analysis

2018-05-03;

2018-08-20;

2018-09-19.

10.3724/SP.J.1006.2018.01793

通信作者(Corresponding author):官春云, E-mail: guancy2011@aliyun.com

E-mail: 812298771@qq.com

本研究由國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2015CB150206)資助。

This study was supported by the National Basic Research Program (973 Program) (2015CB150206).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20180917.1543.004.html