誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在帕金森病治療中的應(yīng)用進(jìn)展

陳枕枕, 牛昱宇

昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 昆明 650500

帕金森病(PD)是一種神經(jīng)退行性疾病，患者在晚期階段伴隨靜止震顫、身體僵硬、運(yùn)動(dòng)障礙等運(yùn)動(dòng)性退化癥狀。其主要病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)(substantial nigra, SN)中多巴胺能神經(jīng)元(DAns)功能異常。然而，人們對(duì)于PD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和有效的治療手段研究還十分有限，主要原因是缺乏有效的研究模型。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)是類似于胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESCs)且具有自我更新和分化潛能的一種干細(xì)胞。2006年，Takahashi等[1]在前人研究基礎(chǔ)上利用病毒載體將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)轉(zhuǎn)入體細(xì)胞中，使其重編程為一種多能干細(xì)胞。次年，Takahashi等[2]又使用類似的方法成功獲得了由人的體細(xì)胞得到的iPSCs。隨著研究的深入，研究人員也得到了非病毒誘導(dǎo)處理得到的iPSCs[3]，為iPSCs在基礎(chǔ)和臨床研究方面奠定了基礎(chǔ)。

雖然以小鼠為代表的PD動(dòng)物模型已得到廣泛應(yīng)用，但仍存在諸多不足：無(wú)法體外直接觀察；不能重復(fù)DAns的變化、路易小體的形成和神經(jīng)突損失的完整過(guò)程；PD患者的尸檢僅能觀察到最終狀態(tài)，而不能重現(xiàn)其發(fā)病過(guò)程。因此，尋找新的能如實(shí)反映PD患者發(fā)病過(guò)程的模型成為研究PD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵所在。而來(lái)源于患者的iPSCs恰好可以彌補(bǔ)動(dòng)物模型的不足：方便體外觀察；能夠完整重現(xiàn)DAns形態(tài)功能異常、內(nèi)部變化的過(guò)程；便于控制由環(huán)境、動(dòng)物個(gè)體差異等因素帶來(lái)的干擾，是模擬PD發(fā)生的病理固有特征和細(xì)胞水平PD研究的最佳選擇。此外，基于iPSCs的自體細(xì)胞移植治療也是近年來(lái)研究的熱門(mén)話題。本文將從iPSCs細(xì)胞模型、自體細(xì)胞移植治療PD等方面介紹iPSCs在PD研究中的進(jìn)展，以期為PD的相關(guān)研究提供參考。

1 iPSCs與PD細(xì)胞模型

研究人員用單基因異常的iPSCs逐步誘導(dǎo)神經(jīng)祖/干細(xì)胞及各類成熟神經(jīng)元(如DAns、DA前體細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等)，通過(guò)控制變量來(lái)觀察該基因?qū)ι窠?jīng)元發(fā)育、病變的影響，因此可用iPSCs細(xì)胞模型來(lái)研究單基因與PD發(fā)病的關(guān)系，從而了解PD的發(fā)病機(jī)制。用來(lái)研究PD發(fā)病機(jī)制的iPSCs模型主要有LRRK2突變、PINK1突變、α-synuclein突變、Parkin突變、GBA突變等類型，科學(xué)家們正是從這些細(xì)胞模型的研究中揭示PD發(fā)病的機(jī)制。

1.1 LRRK2突變

LRRK2突變主要包括N1437H、R1441C、G2019S 3個(gè)位點(diǎn)的突變，其中G2019S是最常見(jiàn)的一種[4]。研究人員在G2019S-iPSC衍生的DAns中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了氧化應(yīng)激、SNCA蛋白積聚、線粒體自噬和DNA受損的現(xiàn)象，與正常DAns相比，G2019S-iPSC衍生的DAns對(duì)氧化應(yīng)激和蛋白酶體應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡更敏感，這些細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)后，SNCA蛋白的表達(dá)水平明顯升高[5,6]。除了氧化應(yīng)激和SNCA蛋白質(zhì)累積現(xiàn)象外，在這些DAns中還可以看到神經(jīng)突數(shù)目和分支減少等現(xiàn)象[7]，而氧化應(yīng)激、SNCA蛋白積聚、線粒體自噬以及DNA損傷都是PD的典型病理學(xué)特征[8]。

1.2 PINK1突變

PINK1編碼線粒體靶向激酶，可以保護(hù)神經(jīng)元免受應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙[9]。2011年，Seibler等[10]通過(guò)PINK1-iPSC誘導(dǎo)的DAns發(fā)現(xiàn)了線粒體去極化、拷貝數(shù)增加和PGC-1表達(dá)上調(diào)等現(xiàn)象。Rakovic等[11]證實(shí)，來(lái)自PINK1-iPSC的Parkin蛋白表達(dá)水平降低，并且由于泛素化功能障礙導(dǎo)致線粒體膜電位喪失而引起間質(zhì)性浸潤(rùn)，這表明PINK1可能與線粒體損傷有關(guān)。更重要的是，在這些DAns中通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染使其表達(dá)PINK1，能夠恢復(fù)由于Parkin基因缺陷引起的線粒體易位，進(jìn)一步驗(yàn)證了PINK1和Parkin的協(xié)同作用[12,13]。

1.3 α-synuclein突變

α-synuclein是路易小體的主要成分，也存在于SNCA三倍體患者的DAns中[14]。2011年，Devine和Byers報(bào)道稱，突觸核蛋白三倍體(AST)患者和正常人SNCA蛋白的表達(dá)量沒(méi)有差異。但分化成DAns時(shí)，與正常神經(jīng)元相比，AST神經(jīng)元中SNCA蛋白的數(shù)量增加了1倍，并且AST神經(jīng)元對(duì)氧化應(yīng)激更敏感，進(jìn)一步證實(shí)了SNCA蛋白積累和氧化應(yīng)激在PD中的重要作用[15,16]。

1.4 Parkin突變

Parkin編碼三亞基連接酶復(fù)合物的組成部分，其介導(dǎo)底物蛋白質(zhì)靶向蛋白酶體降解。它除了與PINK1在線粒體損傷和氧化應(yīng)激中的協(xié)同作用外，也與DA的內(nèi)平衡有關(guān)，來(lái)自PD患者iPSC衍生的DAns表現(xiàn)出DA吸收降低、釋放增加的現(xiàn)象。由于線粒體功能障礙，這些DAns中的活性氧水平也有所提高，這表明Parkin蛋白可以提高DAns神經(jīng)傳遞的準(zhǔn)確性，抑制DA氧化[17,18]，對(duì)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用[19]。

1.5 GBA突變

GBA基因編碼溶酶體膜蛋白β-葡萄糖腦苷脂酶(也稱為酸性β-葡糖苷酶)，其突變會(huì)導(dǎo)致糖脂底物在溶酶體中積累。葡萄糖腦苷脂酶抗體和溶酶體功能障礙被認(rèn)為是PD的重要致病機(jī)制[20]。2012年，Panicker等報(bào)道，GBA-iPSC衍生DAns顯示出SNCA基因高表達(dá)，并且由于葡萄糖腦苷脂酶(GCase)缺陷，大鼠噬菌體的清除能力下降[21,22]。

這些細(xì)胞模型在體外模擬PD患者的發(fā)病過(guò)程，直觀地反應(yīng)細(xì)胞之間的聯(lián)系、功能損傷直至完全壞死的過(guò)程，但也有其不足之處。目前培養(yǎng)細(xì)胞一般是貼壁培養(yǎng)，但細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)部相互之間聯(lián)系的緊密程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)培養(yǎng)皿中的情況，所以細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所表現(xiàn)出的聯(lián)系程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還需要更為立體的模型來(lái)解決這一問(wèn)題，如3D培養(yǎng)技術(shù)、類腦體的研究等。

2 iPSCs與PD細(xì)胞治療

目前PD的治療方法主要分為三大類：藥物治療、手術(shù)治療和細(xì)胞治療。藥物治療以左旋多巴類藥物為主，這種治療方法雖然在前期治療中效果顯著，但隨著時(shí)間的推移，其效果會(huì)隨耐藥性的產(chǎn)生逐漸降低甚至消失，且對(duì)患者有很大副作用。手術(shù)治療適用于藥物治療效果不好、病情難以控制的PD患者，但由于風(fēng)險(xiǎn)大、費(fèi)用昂貴、治療效果無(wú)法保證，因而許多患者無(wú)法接受。由于受損細(xì)胞種類單一，又分布在特定的局限空間，這些發(fā)病特點(diǎn)又為細(xì)胞治療提供了先天條件。

2.1 iPSCs技術(shù)與自體細(xì)胞移植

自體細(xì)胞移植(圖1)是采用病人來(lái)源于自身的細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外分化、基因編輯、移植的過(guò)程用于疾病治療的一種手段。目前研究中用于治療的干細(xì)胞主要包括胚胎干細(xì)胞、iPSCs、神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，在治療的過(guò)程中不同類型的干細(xì)胞展現(xiàn)出了各自的優(yōu)劣，相比較于其他幾類干細(xì)胞，iPSCs的來(lái)源最為方便、安全，且分化潛能僅次于胚胎干細(xì)胞，因此成為細(xì)胞治療的首選。

圖1 自體細(xì)胞移植示意圖Fig.1 Transplanting diagram of autologous cells.

Yoshikawa等[23]在大鼠PD模型中的細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)有力地支持了自體移植的可行性及治療效果等問(wèn)題，為一些神經(jīng)系統(tǒng)功能性損傷及缺失疾病的治療帶來(lái)了希望。類似的，中國(guó)科學(xué)家將獼猴iPSCs誘導(dǎo)出的DAns移植入藥物模型猴體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其癥狀得到了明顯改善[24]。2017年，日本科學(xué)家在前人的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別使用健康人和PD患者(非基因突變)iPSC誘導(dǎo)的DA前體細(xì)胞移植入PD猴模型腦內(nèi)，并進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)兩年的觀察，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞成功地在模型猴體內(nèi)存活、增殖并發(fā)揮正常功能，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)致瘤現(xiàn)象，成功緩解了模型猴的癥狀，并發(fā)現(xiàn)PD患者與健康人來(lái)源的iPSCs同樣具有治療效果[25]。也就是說(shuō)，對(duì)于非基因突變型患者而言，不需要經(jīng)過(guò)體外修復(fù)過(guò)程，就可以達(dá)到治療效果。而對(duì)于家族性PD患者，則需要通過(guò)體外基因編輯對(duì)突變基因進(jìn)行修飾，才可以得到具有正常功能的DAns，達(dá)到細(xì)胞治療的效果。

雖然細(xì)胞移植治療PD是比較理想的方法，但也存在諸多不足。首先，在體內(nèi)分化的DAns是否會(huì)因?yàn)榛虍惓６鵁o(wú)法正常發(fā)揮功能，這需要對(duì)基因突變型患者來(lái)源的iPSCs進(jìn)行體外基因修復(fù)，然后再誘導(dǎo)分化移植回病人體內(nèi)，但基因修復(fù)過(guò)程中會(huì)不會(huì)引入其他突變，這也是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。其次，人體是一個(gè)綜合復(fù)雜的系統(tǒng)，不同細(xì)胞類型之間的聯(lián)系密不可分，雖然iPSCs可以建立PD細(xì)胞模型，但是無(wú)法顯示其移植后與其他類型細(xì)胞相互作用的情況。再次，如何確定移植物的存活、增殖以及是否發(fā)揮正常功能。已有研究使用影像學(xué)結(jié)合同位素示蹤的方法來(lái)追蹤移植物的生存狀況[25]，但該方法還處于探索階段，其準(zhǔn)確性、時(shí)效性還有待提高，距離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)一段路要走。

2.2 細(xì)胞自體移植存在的問(wèn)題

2.2.1細(xì)胞來(lái)源 最初的iPSCs是通過(guò)病毒導(dǎo)入4個(gè)多能性基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中包括致癌基因c-Myc，但致癌基因的重新啟動(dòng)對(duì)于臨床治療來(lái)說(shuō)是一個(gè)潛在的風(fēng)險(xiǎn)，科學(xué)家們?yōu)榇艘哺冻隽舜罅颗υ噲D避開(kāi)致癌基因的使用。2009年，Lin等[26]通過(guò)SB43125 和PD0325901兩個(gè)化學(xué)小分子得到了人iPSCs，這解決了人們擔(dān)心的細(xì)胞來(lái)源安全性的問(wèn)題。之后，小分子重編程體系也不斷完善，更多的小分子被用于重編程中，如Forskolin、CHIR99021、DZNep、RepSox[27]等抑制信號(hào)通路型小分子，以及Staerk[28]發(fā)現(xiàn)的SOX2替代物RepSox 616452、LY-364947、Dasatinib、iPYrazine、PP1等。2015年，Li等[29]用ISX9、I-BET151、CHIR99021、Forskolin 4個(gè)小分子將小鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化得到神經(jīng)元。同年，Hu等[30]也通過(guò)ValproicAcid、CHIR99021、RepSox、Forskolin化學(xué)小分子將阿爾茲海默患者的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。

雖然目前還沒(méi)有報(bào)道研究化學(xué)方法誘導(dǎo)的DAns，但在未來(lái)細(xì)胞移植中，化學(xué)來(lái)源的細(xì)胞(如DAns、DA前體細(xì)胞、NSCs等)致癌風(fēng)險(xiǎn)小，且小分子容易被細(xì)胞代謝，是目前已知多種細(xì)胞來(lái)源里面最為安全的，但DAns的誘導(dǎo)還需更多的研究來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.2.2細(xì)胞功能 對(duì)于家族性PD患者來(lái)說(shuō)，其發(fā)病主要是基因突變引起的，因此，通過(guò)體外基因編輯技術(shù)糾正患者突變基因的表達(dá)，得到正常的DAns/DA前體細(xì)胞也是細(xì)胞治療的關(guān)鍵。

近年來(lái)，以鋅指核酸酶類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)、鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)以及規(guī)律重復(fù)短回文序列簇(clustered regulatoryinterspaced short palindromic repeat, CRISPR)為主的基因編輯技術(shù)不僅成功應(yīng)用于斑馬魚(yú)[31,32]、嚙齒類[33,34]以及非人靈長(zhǎng)類[35,36]等模式動(dòng)物中，還廣泛應(yīng)用于iPSCs的修飾，用于得到基因突變的細(xì)胞模型[37,38]、修飾異?；虻谋磉_(dá)[39～41]等方面。這些研究的順利進(jìn)行使得體外修飾患者異常基因表達(dá)成為可能，也為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

綜上所述，得到非癌變DAns/DA前體細(xì)胞，并通過(guò)基因編輯技術(shù)修飾其突變基因，才可以使iPSCs的應(yīng)用真正離臨床治療更進(jìn)一步。

3 展望

雖然目前的研究發(fā)現(xiàn)已經(jīng)取得了很多成果，但是由于PD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜并且尚不完全清楚，所以在PD的治療中，僅依靠iPSCs是非常局限的，必須要與其他生物技術(shù)相結(jié)合，如基因編輯技術(shù)、細(xì)胞移植技術(shù)等。細(xì)胞移植技術(shù)的迅猛發(fā)展也為PD的治療提供了解決之道，并且在某些疾病研究領(lǐng)域也獲得了重大發(fā)現(xiàn)與發(fā)展[42]。但是PD的病理進(jìn)程錯(cuò)綜復(fù)雜，給臨床應(yīng)用帶來(lái)了很大阻力。一方面，iPSCs或由其衍生而來(lái)的神經(jīng)細(xì)胞移植到患者體內(nèi)后的存活、生長(zhǎng)、遷移及是否發(fā)揮功能仍有待研究；另一方面，移植到病患體內(nèi)的細(xì)胞的安全性更需通過(guò)各類動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行更深層次的研究。